張 倩，李曉霞，董昕欣，顧小雪，曹 振，鄧小雨，胡冬梅，劉 奇，周 智，遇秀玲，翟新驗，田克恭

（1.中國動物疫病預防控制中心，北京 100193；2.北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，北京 100018）

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一［1］。該病常發(fā)生在春、秋產(chǎn)仔季節(jié)，以懷孕母豬，特別是初產(chǎn)母豬感染后流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及新生仔豬死亡為臨床特征，而母體通常缺乏臨診癥狀［2］。自20世紀60年代中期以來，相繼從歐洲、美洲、亞洲等很多國家分離到該病毒或檢測出其抗體。我國也先后在北京、上海、吉林、黑龍江、四川、浙江、湖北、河南、山東、福建等地分離到了多株PPV，血清學調(diào)查陽性率在12.1％ ～84.8％不等。因該病流行面廣、危害嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。

目前已經(jīng)建立了多種檢測PPV的方法，包括病毒分離、分子生物學診斷技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，這些方法在病原檢測或抗體檢測中各有特點，在該病的診斷中發(fā)揮了重要的作用。但如何在此基礎上研制開發(fā)純度高、性能穩(wěn)定的檢測試劑以及更易在生產(chǎn)實踐中推廣應用的快速檢測方法仍然是今后豬細小病毒疾病防治工作的一個重點。單克隆抗體以其高度均質(zhì)性、高度特異性，來源穩(wěn)定等特點［3］，可直接運用于疫病的臨床診斷，尤其是臨床疑似病例的病毒抗原檢測，也可作為原材料廣泛應用于多種診斷方法。本文旨在制備生物活性好、抗體分泌穩(wěn)定的抗PPV的單克隆抗體雜交瘤細胞株，為豬細小病毒病的臨床快速診斷商品化試劑研發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 毒種、細胞和實驗動物

PPV、豬腎細胞（PK-15）和 SP2/0細胞（Sp2/0-Ag14）均購自美國標準菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒I型（PCV-1）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙腦病毒（JEV）均為中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)診斷室保存。SPF級BALB/c小鼠購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心［SCXK（京2005-2004）］。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）、HAT（Sigma公司，貨號 H0262）、HT（Sigma公司，貨號 H0137）、HRP標記的羊抗鼠 IgG（JacksonImmunoResearch，Inc）、HRP標記的羊抗鼠 IgM（Jackson Immuno Research，Inc）、FITC標記的抗鼠 IgG（Sigma公司）、 FITC 標記的抗鼠IgM（Sigma公司）、SBA Clonotyping System/AP kit單抗亞型鑒定試劑盒（Southern Biotechnology Associates，Inc.）。

1.3 病毒增殖與純化

在PK-15細胞傳代后接種PPV，置于37℃5％ C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待75％以上細胞出現(xiàn)細胞病變（CPE）后收毒，收獲的病毒凍融處理3次，然后用聚乙二醇（PEG）濃縮，再經(jīng)差速離心，最后用蔗糖梯度密度離心純化［4］。

1.4 免疫

用純化的PPV與等量的弗氏完全佐劑混勻后，腹腔和背部皮下多點注射SPF級BALB/c小鼠（6～8周齡、雌性）。此后，每間隔兩周用混合弗氏不完全佐劑的抗原液進行加強免疫。兩次加強免疫后，于融合前3天，脾臟或腹腔注射200μg抗原液加強免疫。

1.5 間接ELISA篩選方法的建立

采用間接ELISA方法，按方陣法確定包被PPV純化蛋白抗原、抗體的最適工作濃度。以TMB為底物，測定OD450值。以陽性血清 OD值在1.0左右，同時與陰性血清OD值差距最大的抗原包被濃度、抗體稀釋度為最佳工作濃度。

1.6 細胞融合［3］

將免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞按5∶1比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合，融合后置HAT選擇性培養(yǎng)基，將其加入到鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 陽性雜交瘤細胞的克隆化［5］

對融合后的陽性細胞用有限稀釋法進行4次克隆，使陽性率達100％。將最終篩選出的強陽性單克隆細胞擴大培養(yǎng)，一部分凍存?zhèn)溆?，一部分用于大量制備單克隆抗體。

1.8 單克隆抗體的制備及純化

取8～12周齡SPF級BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細胞，所得腹水用親和層析法進行純化。

1.9 單克隆抗體的鑒定

1.9.1 雜交瘤細胞染色體分析［6］

按常規(guī)方法進行雜交瘤細胞染色體分析，于高倍顯微鏡下觀察，每份樣本應計數(shù)100個完整的中期核細胞，記錄染色體數(shù)目的分布。

1.9.2 單克隆抗體效價及亞型的測定

采用已建立的間接 ELISA方法測定細胞上清及腹水中單克隆抗體的效價。按照SBA Clonotyping System/AP kit單抗亞型鑒定試劑盒說明書進行單克隆抗體亞型的測定。

1.9.3 單克隆抗體特異性鑒定

1.9.3.1 交叉反應：以PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV為包被抗原，用腹水分別與其進行交叉檢測，用間接ELISA方法測定OD450nm值。

1.9.3.2 免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）：用PPV同步接種含 PK-15細胞的 96孔培養(yǎng)板，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后用-20℃無水乙醇固定。按方陣法確定的腹水、HRP標記羊抗鼠IgG （IgM）的最佳工作濃度和反應時間進行IPMA檢測，經(jīng)AEC進行底物顯色，蘇木素襯染細胞核后，于顯微鏡下觀察。

1.9.3.3 間接免疫熒光檢測方法（IFA）：細胞板的制備和固定同 1.9.3.2。按方陣法確定的腹水、FITC標記羊抗鼠IgG（IgM）工作濃度和反應時間進行IFA檢測，于熒光顯微鏡下觀察。

1.9.4 雜交瘤細胞穩(wěn)定性鑒定

獲得的2個細胞株經(jīng)穩(wěn)定傳代后液氮凍存，1個月后復蘇，檢測細胞上清抗體效價。再經(jīng)腹腔接種BALB/c小鼠，同樣檢測腹水的抗體效價，并與凍存前效價進行比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖與純化

經(jīng)蔗糖梯度密度離心純化后的PPV蛋白濃度為11 mg/m L。

2.2 間接ELISA方法篩選建立雜交瘤細胞株

根據(jù)方陣法確定間接ELISA方法的最佳 PPV純化蛋白抗原包被濃度為2μg/mL，經(jīng)間接 ELISA篩選，4次克隆化獲得2株穩(wěn)定分泌抗PPV單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為2H9、1F9。

2.3 單克隆抗體的鑒定

2.3.1 雜交瘤細胞染色體計數(shù)

雜交瘤細胞染色體在90～110范圍內(nèi)變化，2H9平均98，1F9平均96。該數(shù)值大于脾細胞染色體數(shù)的兩倍，小于脾細胞與骨髓瘤細胞的染色體數(shù)目之和，表明該雜交瘤細胞確為脾細胞與骨髓瘤細胞融合產(chǎn)物。

2.3.2 單克隆抗體效價及亞型測定

2H9、1F9雜交瘤細胞上清的 ELISA抗體效價均在104以上，腹水的ELISA抗體效價均在107以上。2H9的亞型是 IgG1、kappa鏈；1F9的亞型是IgM、kappa鏈。

2.3.3 單克隆抗體特異性鑒定

2.3.3.1 交叉反應：間接 ELISA檢測結(jié)果顯示，PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV均不與2H9和1F9腹水發(fā)生交叉反應。

2.3.3.2 免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）：腹水1∶400稀釋，HRP標記的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶80稀釋，AEC顯色時，2株單克隆抗體均能與PK-15細胞中的PPV呈中等強度以上反應，可見接種了PPV的PK-15細胞核或細胞漿中出現(xiàn)紅色陽性著染，陰性對照細胞未見陽性反應（封底圖1）。

2.3.3.3 間接免疫熒光方法（IFA）：腹水1∶400稀釋，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶100稀釋時，2株單克隆抗體均能與PK-15細胞中的PPV呈中等強度以上反應，可見接種了PPV的PK-15細胞核或細胞漿中出現(xiàn)黃綠色熒光，陰性對照孔呈暗紅色未見熒光（封底圖2）。

2.3.4 雜交瘤細胞穩(wěn)定性鑒定

2株雜交瘤細胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后液氮凍存，1個月后復蘇，細胞生長良好，抗體分泌水平與凍存前相同。腹腔接種BALB/c小鼠后可致瘤，并穩(wěn)定地分泌特異性抗體。

3 討論

本研究克隆、篩選、鑒定了2株針對PPV的雜交瘤細胞，經(jīng)鑒定證明其分泌的單克隆抗體生物活性好、特異性高、抗體分泌穩(wěn)定，能大量制備，可作為純度高、性能穩(wěn)定的檢測試劑原材料，也可用于PPV檢測商品化試劑盒的研發(fā)，具有廣闊的市場應用前景。

本研究通過對雜交瘤細胞克隆化這一關鍵步驟的把握，使得所制備的單克隆抗體具有陽性克隆多、穩(wěn)定性好的特點。首先在細胞融合后長至孔底的1/2～1/3時進行克隆，避免了陽性細胞漏檢和染色體丟失情況的發(fā)生。采用操作簡便的有限稀釋法，保證了獲得的雜交瘤穩(wěn)定，抗體分泌效價高。經(jīng)過4次克隆化獲得的雜交瘤陽性率均為100％，ELISA檢測證明2H9、1F9交瘤細胞上清效價均達1∶1×104，腹水效價均達1∶1×107。此外，本研究以純化的PPV全病毒作為免疫原，同時在間接ELISA的篩選過程中設立了PK-15細胞的陰性對照，以確保得到特異性強、活性好的單抗。特異性試驗證明2H9、1F9具有高度的特異性，只與 PPV反應，與PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV等相關豬病病毒均無交叉反應。

目前大部分研究制備的 PPV單抗多經(jīng)由ELISA方法篩選得到，并用于 ELISA抗體檢測，如1992年陸萍等獲得3株抗PPV McAbs的雜交瘤細胞株［7］；1993年余太尉篩選出 4株分泌抗 PPV McAbs的雜交瘤細胞系，并用以建立檢測PPV抗體的ELISA［8］；1995年謝琴等得到5株分泌抗 PPV McAbs，用以建立檢測 PPV的 ELISA方法［9］等。而本研究獲得的2株單克隆抗體不僅ELISA效價高，且同時經(jīng)IPMA和IFA方法驗證，均能與接種于PK-15細胞的PPV發(fā)生特異性反應，具有良好的免疫酶活性和熒光活性，因此應用范圍更廣，不僅可用于建立ELISA方法進行PPV抗體或抗原檢測，還可用于建立簡單、快速、特異、敏感的IPMA和IFA檢測方法。下一步，將利用本研究制備的2株PPV單抗建立免疫酶和免疫熒光方法，并應用于可疑的流產(chǎn)和死產(chǎn)胎兒的腎、肺、肝、腦、睪丸和胎盤等臨床樣品冰凍切片的檢測，作為PCR等豬細小病毒病臨床快速診斷方法的補充和驗證。Infect Dis Rev，2000，2：99-109.

［2］吳丹，仇華吉，李昌文等.豬細小病毒sY一99株非結(jié)構蛋白NSl基因的克隆及序列分析［J］.哈爾濱中國預防獸醫(yī)學報07-2002.

［3］徐志凱.實用單克隆抗體技術［M］.西安：陜西科學技術出版社，1992.

［4］殷震，劉景華主編.動物病毒學［M］.第二版.北京：科學技術出版社.1997，310-318

［5］James W.Goding.Monoclonal Antibodies：Peinciples and practice.Academic press.Inc.Ltd.1983

［6］鄂征主編.組織培養(yǎng)和細胞生物學技術（第一版）［M］.北京：北京出版社.

［7］陸萍，胡志賢，王國豐，等.抗豬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及初步應用［J］.上海農(nóng)學院學報，1992，10 （2）：101-107.

［8］俞太尉，丘惠深.抗豬細小病毒單克隆抗體的研制及初步應用的研究［J］.中國畜禽傳染病.1993，1：55-57.

［9］謝琴，王東，何存利，等.分泌豬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立［J］.中國畜禽傳染病.1995，5：48-50.