王 碩，蘇 杭，袁經(jīng)權，繆劍華

(1.廣西藥用植物研究所姚新生院士重點實驗室，南寧 530023；2.廣西醫(yī)科大學，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)學院，南寧 530001)

1902～1908年 Jensen［1］使用實驗小鼠進行腫瘤移植方面的研究，開始確立了小鼠在癌癥研究中潛在的價值。小鼠體型小、繁殖周期短、產(chǎn)仔數(shù)多、容易飼養(yǎng)、腫瘤生長迅速，且遺傳資源極為豐富。到目前為止，已培育出400多個近交系小鼠，發(fā)現(xiàn)了大量突變基因［2-3］。近 20多年來，轉基因小鼠［4］、基因敲除小鼠［5］等遺傳工程小鼠相繼培育成功。小鼠基因組測序工作也已經(jīng)完成，并且發(fā)現(xiàn)，小鼠的基因組和人類基因組序列非常相似，幾乎所有人類基因都可以在小鼠身上找到同源基因［6］，由此推斷，只要克隆出與人類腫瘤形成有關的基因就可以克隆出小鼠相應的基因，用于人類腫瘤生物學及腫瘤預防、治療研究。反之，通過研究小鼠基因又可以更加深刻地了解人類基因的功能。在小鼠的基因組中發(fā)現(xiàn)并定位了許多癌基因、腫瘤抑制基因，這是其它動物(如果蠅、線蟲或大鼠)模型所無法比擬的，決定了小鼠是研究人類腫瘤理想的模型動物。因此，了解小鼠的生物學特性、癌癥研究中常用的普通小鼠模型、GEM模型及利用這些GEM癌癥模型取得的最新進展等，對研究人類癌癥非常有益，本文就這些方面的內容加以綜述。

1 腫瘤研究中常用的小鼠模型

1.1 自發(fā)和誘發(fā)腫瘤模型

自發(fā)性小鼠腫瘤模型是指小鼠未經(jīng)任何有意識的人工處理，在自然情況下產(chǎn)生腫瘤。現(xiàn)有的近交系小鼠中，有許多品系是自發(fā)的高癌品系。如AKR小鼠，6～8月齡淋巴細胞性白血病自發(fā)率高達70%～80%；C3H/He小鼠乳腺癌發(fā)生率在繁殖雌鼠中為97%。使用這些小鼠可以研究人類腫瘤的發(fā)生及特性。

誘發(fā)腫瘤模型是使用致癌物質或放射線在一定條件下誘發(fā)小鼠腫瘤，是實驗腫瘤學研究常用的方法。誘發(fā)性腫瘤分為物理因子誘導，化學誘導和病毒誘導三類。可能誘發(fā)腫瘤的物理因子極多，幾乎所有的放射性元素在實驗中均能引發(fā)腫瘤，尤以放射性超鈾元素為最明顯。1941年 Loreny和Stewart［7］首次發(fā)現(xiàn)用二甲葸或甲基膽葸喂養(yǎng)的小鼠會產(chǎn)生小腸腫瘤，隨后人們發(fā)現(xiàn)許多化合物均具有致癌性，主要有多環(huán)芳烴類、亞硝胺類、偶氮染料及黃曲霉素等，而膽汁酸和手術可為輔助致癌因素，能誘導動物產(chǎn)生腫瘤?？烧T發(fā)腫瘤的病毒有FB· RFB及鼠肉瘤病毒，Moloney鼠骨肉瘤病毒(MSV)，SV40病毒 (SV40)，郭霍氏桿菌病毒(BKV)等，致瘤率多在80%以上［8］。

自發(fā)和誘發(fā)小鼠腫瘤模型是在自然條件下發(fā)生的腫瘤，其發(fā)病特征和人類腫瘤很相似，涉及遺傳和環(huán)境等因素，理論上講是很理想的動物模型，對研究人類腫瘤有很高的價值，是研究腫瘤生物學和開發(fā)腫瘤預防藥物的重要模型。但是因為該模型影響因素多，成瘤時間長，均一性差，病理癥狀出現(xiàn)較晚，很難定時作對比研究，也有發(fā)病率低和穩(wěn)定性差的問題，不能建立比較精確的用于腫瘤研究和藥物篩選的要求規(guī)則、整體的模型，且來源較困難，不可能大量獲得，故在實驗中應用的很少。

1.2 可移植腫瘤模型

小鼠自發(fā)瘤可移植性腫瘤模型就是將自發(fā)性腫瘤(腫瘤細胞株)移植到同品系、同品種或異種動物體內建立的荷瘤小鼠模型。

同種異體移植是在同種或同系動物身上移植，供體和受體間的共性大，容易在機體內停留及生長繁殖，再現(xiàn)其腫瘤過程。如，用近交系小鼠 L-1210白血病瘤細胞株，接種于同品系小鼠皮下或腹腔，可導致小鼠白血病。目前按此種方法建立的小鼠腫瘤模型用于腫瘤研究的有：小鼠結腸腺癌CT-26，小鼠肉瘤 S-180，小鼠淋巴細胞白血病 L-1210和P388，艾氏腹水瘤，小鼠網(wǎng)織細胞白血病615，未分化膠質瘤G422，黑色素瘤B-16，F(xiàn)riehd病毒白血病，小鼠肝癌H22，小鼠乳腺癌M5076等，在腫瘤研究中具有重要的意義。

同種移植可供選擇使用的細胞系或細胞株較多，許多細胞系在世界范圍分布廣泛，并且這些細胞的生物學特性已經(jīng)比較明確，一般都有明確的背景資料，使群動物同時接種同樣量的瘤細胞，生長速度一致，個體差異較小，成活率高，易于對照觀察，早期腫瘤的發(fā)生類似自發(fā)瘤，特征明顯、重復性好，移植的腫瘤細胞生物特性較穩(wěn)定，這些都是便于科研成果相互比較和交流的有利因素，故成為國內外常用的腫瘤動物模型復制方法之一。但是，可移植的腫瘤細胞株沒有遺傳背景的改變，它的生長受周圍組織影響，與人類自然發(fā)生的腫瘤不同，因此，移植瘤模型在篩選作用于實體瘤的藥物上需要尋找新的突破。

裸小鼠的發(fā)現(xiàn)是人類在癌癥研究中的一個重要突破，從此，可以把人類的腫瘤移植到小鼠身上進行研究。在此之前，人類腫瘤只能接種到動物免疫特許的區(qū)域，如眼窩、腦內、頰囊等部位，操作不方便，最終還要被排斥。1966年發(fā)現(xiàn)的裸小鼠［9］和1983年發(fā)現(xiàn)的小鼠嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)［10］，都是單基因隱性突變形成。裸小鼠無毛、無胸腺，T細胞免疫功能缺陷；SCID小鼠淋巴結、胸腺變小，缺少完成 Ig和 T細胞受體基因重組的功能，因而其T、B細胞免疫功能嚴重缺乏。因為裸小鼠和SCID小鼠免疫缺陷，人類的腫瘤和免疫活性細胞很容易在它們體內生長而不被排斥。如，將人胎兒的組織移植到SCID小鼠，人組織在SCID小鼠體內保持正常的結構和功能，用這個攜帶有部分人體組織微環(huán)境的“SCID-human”小鼠模型，可以研究人類腫瘤的生長和轉移，以及人癌細胞與人體組織環(huán)境之間的關系［11］。

裸鼠和SCID小鼠皮下是移植人類腫瘤的理想位置，操作簡單，是體內篩選抗癌藥物主要選擇的部位。目前，人類大多數(shù)腫瘤在裸鼠體內移植成功。移植瘤的特性、宿主因素、接種部位、激素和宿主性別的依賴性等都影響人類腫瘤裸鼠移植效果?？赡苁怯捎谒拗鞯种谱饔?特別是 NK細胞的活性)，裸鼠皮下移植的人類腫瘤很少發(fā)生轉移和侵襲臨近組織，但卻保持人類腫瘤的形態(tài)和生化特征。在腫瘤異體移植方面，有人認為SCID小鼠是比裸鼠更適合人類癌細胞生長和轉移的動物模型，并且在研究人類腫瘤生物學和評估腫瘤治療方法上有獨到之處［12］。

原位移植腫瘤，即將腫瘤細胞移植于與腫瘤原發(fā)部位相同的裸鼠臟器內。原位移植動物模型是目前最常用的提高腫瘤自發(fā)轉移率的模型，因為腫瘤細胞的生長需要同源組織間質細胞的支持［13］，原位移植腫瘤模型中腫瘤的微環(huán)境與原來器官相似，所以比單純皮下移植等非同源一直的轉移率高［14］。腫瘤細胞植入皮下等非同源器官很難建立符合人類腫瘤自然轉移規(guī)律的動物模型，因為非同源組織微環(huán)境對腫瘤細胞生長影響較大，而同源組織的微環(huán)境對腫瘤細胞生長影響較小。1991年 Fu等［15］利用結腸癌病人的腫瘤標本建立了裸鼠結腸癌原位移植轉移模型，1993年 Furukawa等［16］用完整胃癌組織塊法建立了裸鼠胃癌原位移植模型，1996年我國學者孫肪憲［17］建立了裸鼠原位移植高轉移癌癥模型。有些腫瘤只有將其進行原位移植才能表型出轉移表型，如人腎癌細胞KG-2細胞接種于裸鼠腎臟時，可以發(fā)生肺轉移，而接種于裸鼠皮下時則表現(xiàn)轉移里喪失［18］。這些研究結果表明接種的微環(huán)境對于異質性生長的腫瘤中選擇遇有轉移能力的細胞亞群具有重要影響。在腫瘤原位移植模型中，組織學完整的腫瘤塊原位移植法比腫瘤細胞懸液原位注射法轉移發(fā)生率高，可信性高［19-20］。原位移植腫瘤模型不僅可以為腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制的研究提供幫助，而且可以更真實地反映抗腫瘤策略的效果。

可移植腫瘤模型應用廣泛，因其容易操作，動物成瘤穩(wěn)定，均一性好，發(fā)病率高，成瘤時間差異不大，容易施加干擾因素等特點，仍是目前研究最多的腫瘤模型。

1.3 遺傳工程小鼠模型

隨著人們對機體分子、細胞生物學特性及遺傳工程研究的深人和與之相關的研究方法的改進，以上腫瘤模型不能滿足全方位研究腫瘤的需要，腫瘤基因模型應運而至。腫瘤基因模型目前研究使用的主要有以下二種。

轉基因腫瘤模型，轉基因腫瘤動物模型是指借助基因工程技術將確定的腫瘤外源基因通過生殖細胞或早期胚胎干細胞導入宿主的染色體上，在其基因組內穩(wěn)定地整合導入的外源腫瘤基因，并能遺傳給后代的一類腫瘤動物。1980年，Gordon［4］首次利用雄性前核注射的方法制作成功轉基因小鼠，隨后，前核注射、逆轉錄病毒介導的基因轉移技術等作為重要基因操作手段在生物醫(yī)學的各個領域發(fā)揮重要作用。正常細胞惡性病變的根本原因在于基因突變，從基因水平研究腫瘤的形成、發(fā)展與演進，開創(chuàng)了腫瘤研究的新紀元。分子克隆技術、微注射技術等高科技的出現(xiàn)，為轉基因腫瘤動物模型的建立鋪平了道路。

基因敲除腫瘤模型，基因敲除是通過同源重組技術將外源基因引入胚胎干細胞，然后將胚胎干細胞注射到胚胎的胚囊中，后代是攜帶外源基因的嵌合體動物，通過繁殖、選擇，可得到純合帶有靶突變基因敲除或基因替換的小鼠［5］。Es細胞打靶技術建立的第一個抑癌基因動物模型是P53-/-小鼠，隨后又建立了PgP、hns2、P27KIP、erbB2、Vim、IL-7、ATM等動物模型。這些模型在探討腫瘤發(fā)病機制，診斷、預防及基因治療等方面起到了不容忽視的作用。

利用轉基因和基因敲除技術，幾乎可以把所有的變異引入小鼠基因組，包括將基因功能全部去除的全突變或點突變。此外，還可造成復雜的染色體重組，如大區(qū)域缺失、轉位及倒位［21］。通過小的干擾RNA封閉內源基因的表達，也已經(jīng)制作成功基因封閉小鼠［22］。轉基因技術日新月異，使得我們能夠制作出更復雜、更類似于人類癌癥發(fā)病過程的GEM模型［23-25］。一旦某個人類疾病基因被克隆，很容易組建一個在相應基因中有相同突變的小鼠。由于人類的遺傳結構在許多方面和小鼠非常接近，我們把一些重要的與人類癌癥相關的基因，利用遺傳工程技術在小鼠基因組中作一定的改變，小鼠也因此會發(fā)生類似的病理改變，這樣的GEM就可以作為研究人類癌癥的模型。GEM模型與人類癌癥患者的表型有相似之處，可用于研究人類癌癥發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、新藥開發(fā)等。

轉基因腫瘤模型和基因敲除腫瘤模型建立在離體和在體相結合的基礎上，在分子和細胞水平上進行操作，由動物整體水平產(chǎn)生效應，因此使我們更完整的去探討腫瘤的遺傳發(fā)病機制、腫瘤細胞與機體之間的免疫學關系、腫瘤的發(fā)展演變及凋亡。目前，已經(jīng)培育了大量的攜帶人類癌基因、抑癌基因的GEM品系，建立了小鼠腫瘤模型遺傳學和病理學資源數(shù)據(jù)庫［3］。

GEM模型在腫瘤研究上具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢。如腫瘤在小鼠器官內的形成是自然發(fā)生的，不是異體移植的；腫瘤的自然生長率和轉移特性與人類相似；腫瘤在自然宿主體內沒有免疫原性，克服了宿主對腫瘤的排斥作用。因此，GEM模型比前面幾種小鼠模型更適合于人類腫瘤生物學的研究。但是，GEM模型也不能完全真實地模擬人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如，將癌基因導入到小鼠基因組之后，癌基因往往過早的在不止一種細胞類型中過度表達，而人類的癌基因多在中老年后在一種細胞類型中表達、發(fā)展成癌。因此，在一些應用研究領域(如抗癌藥物篩選方面)，GEM模型還沒有得到充分利用。目前很多癌基因及原癌基因本身的定位、結構及其功能尚不清楚，仍然在不斷地探索階段，因此所建立的轉基因動物成功率相對較低。這種模型盡管發(fā)生率很低，實際操作上也有許多問題尚在探索中，卻讓我們看到了曙光。

2 小鼠腫瘤模型的局限性

小鼠是嚙齒類動物，而人類屬于靈長類，二者的遺傳關系較遠，從小鼠模型得到的結果有時候難以外推到人類。如，Marsoni等［26］分析了 1970～1985年NCI進入Ⅱ期臨床試驗的75種藥物，發(fā)現(xiàn)利用小鼠移植腫瘤模型篩選的抗腫瘤藥物只有30%在臨床上有活性，說明移植腫瘤動物模型并不能很好的反映藥物的臨床活性。移植腫瘤不是腫瘤的原發(fā)部位，而且與宿主組織之間缺乏類似于人類腫瘤和臨近組織的相互作用。此外，使用小鼠研究人類腫瘤的局限性還表現(xiàn)在免疫性、感染等方面。由于存在對異體移植腫瘤的免疫性，使得普通小鼠模型在免疫治療和腫瘤疫苗研究方面應用價值不大。實驗小鼠感染的一些病毒(如小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒)也可能影響腫瘤接種效果或模型表型變化。種的差異性也是所有動物模型都遇到的問題。有些生物學特性可能不存在種間的交叉性，這就要求使用與人類親緣關系比較接近的動物(如非人靈長類)模型或者其它系統(tǒng)。小鼠與人類存在著一定的差異，使小鼠癌癥模型只能部分反映人類癌癥的特性［27］。

3 小鼠腫瘤模型的展望

理想的動物模型應該能良好地模擬疾病的自然狀態(tài)，并能體現(xiàn)出疾病的主要特點，雖然目前建立的模型較多，但是沒有一種模型能完全滿足研究者的需要，相對而言GEM模型是目前眾多模型中較為理想的模型。

在藥物研究方面，一年使用幾百萬只小鼠篩選抗腫瘤藥物的途徑可能會被更有效的體外篩選方法所取代。但是，在人類腫瘤研究方面，目前還沒有更好的方法能夠完全替代動物模型。當篩選出有效的和感興趣的藥物時，進行臨床前的動物實驗是不可回避的。在克服異體移植腫瘤模型缺陷方面，GEM癌癥模型似乎顯示了很大的潛力，但能否真正用在抗癌藥物的篩選上，還有待于進一步研究［23］。隨著制作GEM策略的不斷完善，小鼠腫瘤模型將越來越復雜，非侵入的小鼠腫瘤的成像技術是需要研究的重點領域之一。如，用特殊的成像系統(tǒng)，檢測基因的表達情況、確定抗癌藥物是否到達靶點，以追蹤治療效果等。計算機X射線斷層掃描、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層攝影術等已經(jīng)用在小鼠腫瘤成像上［24］。新的特殊的腫瘤細胞標記技術也在不斷發(fā)展，如小鼠腫瘤細胞表達綠熒光蛋白，在熒光下可以直接觀察到腫瘤細胞［28］。這些成像技術的不斷改進，將對研究腫瘤原發(fā)部位、腫瘤轉移以及藥物對腫瘤細胞的作用等帶來希望。今后，人類癌癥研究最重要的模型仍將是GEM研究重點可能集中在采用更理想的策略開發(fā)GEM模型以及模型標準化、模型應用范圍擴大等領域。隨著研究的深入以及各種技術的完善，人們將逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)病機制、腫瘤與宿主的關系、腫瘤侵襲與轉移過程，從而建立起與人腫瘤疾病更相近的動物模型。

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