竇建琳，張宏福，唐湘方

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，蘭州 730000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

疾病動(dòng)物模型的開發(fā)與應(yīng)用是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的基本保障，也是比較醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域。勝任動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制的重要工具，也是研發(fā)和評(píng)價(jià)疫苗及藥物的重要實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。SARS、高致病性禽流感、甲型流感、登革熱、手足口病等新現(xiàn)病毒性疾病的爆發(fā)流行已成為了全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，而對(duì)于它們的研究都受到同一難題的制約：缺乏勝任疾病動(dòng)物模型。

引起上述疾病的病毒以人為其重要或者唯一的自然宿主，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物于是就成為建模的首選。雖然有較為成功的案例［1］，但是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的正常體溫高于人類的正常體溫，用以建模的溫度敏感突變株在人體內(nèi)無(wú)法增殖。另外，靈長(zhǎng)類動(dòng)物來(lái)源稀少，該類模型因而經(jīng)濟(jì)性欠佳，無(wú)法保障對(duì)其可重復(fù)性的驗(yàn)證，并且與當(dāng)前重視保護(hù)動(dòng)物權(quán)益的要求有所背離。

普通嚙齒類動(dòng)物對(duì)于上述病毒的易感性較低，馴化病毒以提高毒力和通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行基因操作以影響其疾病易感性是當(dāng)前的主流應(yīng)對(duì)策略［2］。人源化 NOD/SCID小鼠是研究發(fā)病機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)的優(yōu)秀模型，但因其免疫功能缺陷，不能直接用于抗病毒藥物的藥效學(xué)研究和疫苗的評(píng)價(jià)。應(yīng)用基因敲除或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建模面臨的主要問(wèn)題還有：靶點(diǎn)基因的篩選具有難度；易感性相關(guān)基因參與免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、血管發(fā)生等功能，敲除可能具有致死性；敲除或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建模特異性欠佳，可能會(huì)出現(xiàn)非特異病理變化。另外，基因敲除使靶基因的表觀遺傳機(jī)制難于研究，而宿主的表觀遺傳機(jī)制也是其病毒易感性的重要構(gòu)成部分［3］。

疾病動(dòng)物模型最重要的特征是替代復(fù)制性［4］，即充分再現(xiàn)人類疾病的臨床表現(xiàn)和病理特征，并盡可能符合自然感染途徑及免疫狀態(tài)。符合上述特征的動(dòng)物模型不僅有利于發(fā)病機(jī)制的研究，同時(shí)也是評(píng)價(jià)疫苗和抗病毒藥物的主要平臺(tái)。在普通嚙齒類動(dòng)物構(gòu)建勝任的病毒感染模型不但是疾病防控的需求，也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中“3R”（reduction減少，replacement替代及 refinement優(yōu)化）原則的體現(xiàn)。

本文通過(guò)文獻(xiàn)回顧，認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)干預(yù)可有助于在嚙齒類動(dòng)物建立新現(xiàn)病毒的勝任感染模型；營(yíng)養(yǎng)涵蓋范圍廣泛，本文著眼于維生素如維生素D及維生素A、微量元素如硒、錳及腸道菌群與宿主疾病易感性和病毒進(jìn)化的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)解決相關(guān)難題的線索。

1 營(yíng)養(yǎng)與宿主易感性

營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病可增加個(gè)體對(duì)病毒的易感性，1型糖尿病患者感染腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）、柯薩奇病毒等腸道病毒的風(fēng)險(xiǎn)約是其它人群的10倍［5］；巧合的是，在NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠可構(gòu)建較為成功的EV71感染模型［6］。這提示宿主的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)與其疾病易感性關(guān)系密切。

營(yíng)養(yǎng)是宿主抵抗力的主要決定因素之一，營(yíng)養(yǎng)不良通過(guò)削弱宿主的免疫防御功能，從而提高病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)［7］。蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核酸等參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育及正常免疫功能的維護(hù)［8］，因此這些基本營(yíng)養(yǎng)成分的變化常導(dǎo)致普遍易感性上升。而維生素、微量元素、益生菌等特殊營(yíng)養(yǎng)成分與特定的病毒易感性相關(guān)聯(lián)［9］。維生素 D的狀態(tài)與HIV的疾病進(jìn)程有密切關(guān)聯(lián)［10］，提高活性維生素D的血清濃度可顯著減低急性呼吸道病毒感染的發(fā)病率［11］?？滤_奇病毒感染硒缺乏的動(dòng)物可構(gòu)建成功的克山病動(dòng)物模型［7］。

過(guò)度營(yíng)養(yǎng)與感染性疾病的關(guān)系也非常密切，過(guò)度營(yíng)養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)不良的登革熱患者癥狀均較嚴(yán)重［12］，但營(yíng)養(yǎng)對(duì)宿主登革易感性的影響缺乏相關(guān)研究。另外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，過(guò)量補(bǔ)充ω-3脂肪酸可削弱宿主對(duì)胞內(nèi)寄生病原的抵抗力［13］。

2 營(yíng)養(yǎng)變化與易感性的機(jī)制

營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致宿主疾病易感性的變化很大程度上是通過(guò)影響免疫功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但是營(yíng)養(yǎng)成分也可直接干預(yù)病毒的毒力、作用于病毒的進(jìn)化。

2.1 營(yíng)養(yǎng)與病原毒力及進(jìn)化

砷能夠影響病毒的復(fù)制和抑制感染［14］，而硒與病毒的感染關(guān)系也十分密切。在低硒飲食的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，柯薩奇病毒和流感病毒的毒力得以增強(qiáng)；單純皰疹病毒1型卻在高硒狀態(tài)下毒力更強(qiáng)。不同病毒對(duì)硒的不同反應(yīng)證實(shí)硒可直接影響病毒的毒力。上述弱毒株在硒缺乏的小鼠轉(zhuǎn)變?yōu)槎玖χ陼r(shí)，病毒基因會(huì)發(fā)生變異，出現(xiàn)毒力決定基；如果敲除硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染病毒時(shí)也有類似的表現(xiàn)。因此營(yíng)養(yǎng)直接與病毒進(jìn)化相關(guān)，也是新生病毒出現(xiàn)的原因之一［7，15］。究其原因，可能是因?yàn)槲⒘吭厥遣《綬NA多聚酶發(fā)揮活性的保障，同時(shí)RNA多聚酶也是病毒變異的“熱點(diǎn)”，微量元素的變化促進(jìn)了病毒的變異和進(jìn)化?？滤_奇病毒及流感病毒的RNA多聚酶活性依賴于硒，而EV71的RNA多聚酶活性依賴于錳［16］，提示可通過(guò)干預(yù)錳的含量來(lái)提高宿主對(duì)EV71的易感性，如同在硒缺乏的動(dòng)物構(gòu)建克山病動(dòng)物模型一樣來(lái)開發(fā)良好的手足口病模型。上述結(jié)果也顯示了營(yíng)養(yǎng)干預(yù)有可能取代基因敲除用于開發(fā)病毒感染動(dòng)物模型。

2.2 營(yíng)養(yǎng)與粘膜免疫

免疫細(xì)胞功能旺盛、代謝活躍，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)的變化較為敏感。營(yíng)養(yǎng)變化對(duì)固有性及適應(yīng)性免疫功能均可產(chǎn)生影響，由此可調(diào)節(jié)宿主對(duì)非胃腸道及胃腸道途徑傳播病毒的易感性。營(yíng)養(yǎng)攝入的重要途徑是經(jīng)消化道吸收，消化道也正是粘膜免疫發(fā)揮作用的重要場(chǎng)所，通過(guò)影響粘膜免疫，營(yíng)養(yǎng)因而可更直接地干預(yù)腸道病毒的感染。

粘膜免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)包括屏障結(jié)構(gòu)、分泌型IgA及重要的免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8ααT細(xì)胞等；而屏障結(jié)構(gòu)中除了有腸上皮構(gòu)成的物理屏障、消化液參與構(gòu)成的化學(xué)屏障外，腸道菌群也參與構(gòu)成生物屏障。粘膜免疫與免疫耐受的動(dòng)態(tài)平衡維持了對(duì)食物的口服耐受，確保營(yíng)養(yǎng)的攝入；在清除病原微生物的同時(shí)，使共生或益生微生物能夠長(zhǎng)期定居［17］?；钚跃S生素通過(guò)其受體調(diào)節(jié)使腸道內(nèi)淋巴組織的T細(xì)胞歸巢，這一作用受抑制后，腸粘膜淋巴結(jié) CD8ααT細(xì)胞數(shù)目減少，導(dǎo)致IL-10分泌水平降低，從而對(duì)共生菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答［18］。維生素A可通過(guò)維甲酸受體活化樹突狀細(xì)胞從而改善粘膜免疫［19］。而腸道菌群通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路與粘膜免疫相互作用，從而調(diào)節(jié)腸道屏障的完整性［20］。

腸上皮由單層上皮細(xì)胞組成的，是腸腔內(nèi)食源性成分、微生物與免疫系統(tǒng)相互作用的界面。細(xì)胞間有由緊密連接蛋白與肌動(dòng)蛋白組成的緊密連接，通過(guò)它可調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性。腸道微生物通過(guò)影響胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，改變緊密連接蛋白的表達(dá)和分布，共生或者益生菌可增加細(xì)胞周邊的緊密連接蛋白含量；食物某些成分亦可通過(guò)緊密連接蛋白調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性［21］。隨著粘膜免疫與免疫耐受的平衡紊亂，免疫耐受被打破，物理屏障遭到自身抗體及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的破壞；對(duì)共生菌及益生菌產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，不但直接削弱生物屏障作用，而且也導(dǎo)致了共生菌及益生菌對(duì)物理屏障調(diào)節(jié)作用的下降；益生菌參與食物的消化及營(yíng)養(yǎng)的吸收，其被清除，導(dǎo)致具有腸屏障調(diào)節(jié)作用的營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z入下降，進(jìn)一步加重了腸道屏障的破壞程度［22，23］。上述過(guò)程直接增加了宿主對(duì)腸道病毒的易感性。

綜上所述，營(yíng)養(yǎng)與粘膜免疫的相互作用可影響宿主的病毒易感性，尤其對(duì)于腸道病毒更具有直接的影響，因此通過(guò)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)構(gòu)建勝任的EV71等腸道病毒感染動(dòng)物模型就有高度的可行性。另外，腸道菌群是粘膜免疫的重要組成部分，無(wú)菌或悉生動(dòng)物因腸道無(wú)菌群或與普通動(dòng)物不同，因此基于它們的模型并不能充分反映病毒的自然感染途徑和移行。

3 營(yíng)養(yǎng)方式與動(dòng)物模型

營(yíng)養(yǎng)可通過(guò)雙向性、劑量依賴效應(yīng)及病原依賴等方式影響疾病易感性，營(yíng)養(yǎng)不良及過(guò)度營(yíng)養(yǎng)都可能提高宿主的疾病易感性［24］。對(duì)于宿主病毒易感性產(chǎn)生影響的營(yíng)養(yǎng)成分眾多，并且微量元素及維生素等的變化精細(xì)，因此需要通過(guò)新的營(yíng)養(yǎng)方式保證營(yíng)養(yǎng)成分較精確地?cái)z入。另外，感染導(dǎo)致的免疫功能變化反饋調(diào)節(jié)瘦素，通過(guò)影響食欲使攝食量發(fā)生變化［25］，從而營(yíng)養(yǎng)攝入發(fā)生變化，免疫功能及易感性隨之又發(fā)生變化，建模動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)、免疫及易感性實(shí)質(zhì)處于不穩(wěn)定的狀態(tài)。因此營(yíng)養(yǎng)是動(dòng)物模型有效性發(fā)揮的前提，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)化可縮小為消除誤差而設(shè)置的樣本規(guī)模，從而降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的消耗。值得注意的是，營(yíng)養(yǎng)、免疫與感染的相互作用還可導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度的改變［12］，因此在藥物和疫苗評(píng)價(jià)時(shí)，如果無(wú)法保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)背景均質(zhì)，則可能導(dǎo)致失真結(jié)果的出現(xiàn)。因此，在動(dòng)物模型開發(fā)和應(yīng)用的全程，均應(yīng)保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)方式主要有自由取食和強(qiáng)制營(yíng)養(yǎng)。穩(wěn)定營(yíng)養(yǎng)的前提是等量攝入成分一致的飼料，自由取食很難保證。強(qiáng)制營(yíng)養(yǎng)可保證定量攝食，但與自主咀嚼相比，它不僅抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率［26］。應(yīng)用自愿營(yíng)養(yǎng)模型或者配方飼料手工喂養(yǎng)是克服上述缺點(diǎn)的有效手段［27-29］。定量攝食是營(yíng)養(yǎng)均質(zhì)化的開端，開發(fā)二代營(yíng)養(yǎng)模型可提供進(jìn)一步的保障。親代包括母系及父系都對(duì)后代的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)產(chǎn)生重要影響，并且包括營(yíng)養(yǎng)在內(nèi)的環(huán)境因素造成的表觀遺傳變化也能通過(guò)哺乳動(dòng)物的生殖而遺傳［30，31］，因此在親代應(yīng)用自愿營(yíng)養(yǎng)法就有可能獲得營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)均質(zhì)、穩(wěn)定的子代。在此二代營(yíng)養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行病毒感染模型的構(gòu)建，將有助于當(dāng)前難題的克服。

4 結(jié)語(yǔ)

在新現(xiàn)病毒性疾病的研究中，缺乏勝任動(dòng)物模型是重要的限制“瓶頸”。除了應(yīng)用不依賴于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方法外［32］，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)宿主的病毒易感性以建立符合“3R”原則并可充分再現(xiàn)人類疾病特征的動(dòng)物模型具有可實(shí)踐性。

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