葉成玉，王戈平，陸 艷，蔡其剛，牛小迎，李曉卉，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016）

馬巴貝斯原蟲病是馬屬動物包括（馬、驢、騾和斑馬）的一種蜱媒病，這種疾病是由馬屬小巴貝斯原蟲[babesia（theileria）equi]和馬巴貝斯原蟲（babesia caballi）血源性寄生原蟲引起的。其死亡率取決于受侵害動物的總體免疫狀況及病原生物的毒力。高死亡率常發(fā)生在從無巴貝斯原蟲的區(qū)域引進(jìn)到巴貝斯原蟲流行地區(qū)的最初感染的馬匹中。

在流行地區(qū)，嚴(yán)重的巴貝斯原蟲病的臨床病例病情相對罕見，馬屬動物巴貝斯原蟲病在歐洲、非洲、阿拉伯、亞洲（日本除外）的許多地區(qū)流行。由于潛在的蜱媒介幾乎全球分布，必須防止攜帶者引入到非流行地區(qū)或國家[1]。在進(jìn)口到非流行地區(qū)或國家之前，通過對馬屬動物巴貝斯原蟲病血清學(xué)試驗必須證明是陰性的[1-3]。目前，補體結(jié)合試驗（CFT）的和間接熒光抗體試驗（IFAT）通常用于檢測B.equi和B.caballi寄生蟲抗體的存在。

然而，這些血清學(xué)試驗受到抗原供應(yīng)有限和特異性差的限制[1-2]。最近，我們開發(fā)了采用重組抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA試劑盒），并表明該ELISA試劑盒可以分別替代CFT和IFAT作為B.equi和B.caballi感染的診斷方法[4-9，11-13]。在本研究中，我們用重組抗原的ELISA診斷試劑盒對中國新疆西部驢的馬屬動物巴貝斯原蟲病的流行進(jìn)行了調(diào)查。

青海省位于中國西北部，是中國最大的內(nèi)陸省。氣候是具有溫暖的夏天和寒冷的冬天主要是氣候干燥的大陸，平均氣溫夏季（7月）為25.7℃（喀什）或22.7℃（伊犁）及冬季（1月）-6.0℃（喀什）或-9.5℃（伊犁）。馬屬動物是這青海地區(qū)重要的動物，并被當(dāng)?shù)厝嗣駨V泛用于交通運輸，至今青海的馬屬動物還沒有關(guān)于馬巴貝斯原蟲病流行的報道，而臨近的新疆地區(qū)的馬屬動物有馬巴貝斯原蟲病流行的報道[15]。

1 材料和方法

1.1 重組抗原

1.1.1 一種用以大腸桿菌表達(dá)重組截短的巴貝斯蟲裂殖子抗原2（EMA2t）并通過pGEX傳播媒介的ELISA法，對于驢上B.equi感染的診斷，如前所述進(jìn)行[7]。

1.1.2 一種采用以大腸桿菌表達(dá)重組的Bc48蛋白并以pGEX為傳播媒介的ELISA方法，用于對驢上B.caballi感染的診斷，采用別處描述的方法進(jìn)行[8-9]。

1.1.3 陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，均為日本國家原蟲中心玄學(xué)南博士惠贈，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)所生物技術(shù)研究室保存。

1.2 被檢血清的采集和處理

1.2.1 317份馬屬動物血清血清樣品均采自青海省，其中：馬血清192份（分別采自烏蘭縣76份；德令哈市18份；湟源縣98份）；騾血清46份（互助縣19份；民和縣27份）；驢血清79份（湟中縣）。

1.2.2 采血時均空腹、橈靜脈采集，采集后擺成斜面，置 4℃冰箱5 h后，放在室溫待血清析出后收集血清，-20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材

均購自國內(nèi)和 Sigma公司供應(yīng)商。

1.4 ELISA方法

1.4.1 抗原的包被 重組的B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST作為抗原，按10μg/mL劑量加到包被液中（50mm carbonate-bicarbonate buffer，pH9.6），混勻后加到 96 孔平底微量板（Nunc，Denmark）的孔里，每孔50μL，并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS沖洗液沖洗一次后，殘留的粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液進(jìn)行封阻，每孔100μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗一次，在封阻液中按1:100滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的兩個孔中，每孔50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1:4000滴度稀釋辣根過氧化物酶結(jié)合了山羊抗馬、騾和驢的 IgG 抗體（Bethyl Laboratories，USA），稀釋后每孔加50μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100μL底物，每mL底物中含有0.3 mg的 1，2’-azino-bis（3-ethylbenz-thia zoline-6-sulfonic acid），0.1M 檸檬酸，0.2M的磷酸緩沖液和0.003%H2O2，每孔加100μ L。

1.4.6 讀數(shù) 用Wellscan MK 3酶標(biāo)讀數(shù)儀（Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在光吸收值OD415nm條件下測定光吸收值。

1.4.7 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.2，在B.equi GST-EMA2t蛋白、B.caballi GST-Bc48和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值（OD值）。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.3；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.2；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.2為陽性，低于0.2為陰性。

2 結(jié)果

經(jīng)過對所收集的317份馬屬動物血清抗體的檢測，共檢出B.equi血清16份，陽性率為5.05%；B.caballi血清11份，陽性率為3.47%；其中烏蘭縣的76份馬血清中檢出B.equi血清3份，陽性率為3.95%；B.caballi血清2份，陽性率為2.63%；德令哈市的18份馬血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為11.11%；B.caballi血清1份，陽性率為5.56%；湟源縣的18份馬血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為2.04%；B.caballi血清2份，陽性率為2.04%；互助縣的19份騾血清中檢出B.equi血清2份，陽性率為10.05%；B.caballi血清0份，陽性率為0%；民和縣的27份騾血清中檢出B.equi血清3份，陽性率為11.11%；B.caballi血清2份，陽性率為7.41%；湟中縣的79份驢血清中檢出B.equi血清4份，陽性率為5.06%；B.caballi血清2份，陽性率為5.06%。同時有4分血清既是B.equi陽性和又是B.caballi陽性，其中2份來自烏蘭縣的馬血清，2份來自湟中縣的驢血清。結(jié)果初步說明我省馬屬動物群中存在B.equi和B.caballi的感染，詳見表1。

3 討論

中國以前僅有少量的關(guān)于馬equinebabesiosis流行的報道[12-14]。近年來，關(guān)于馬equine babesiosis的報道增多。因此，引起了分別在中國西北部和東北部的新疆和吉林省的高度關(guān)注。據(jù)我們的了解，這是在中國驢匹上關(guān)于馬屬動物巴貝斯蟲病調(diào)查描述的首次報道。在與中國新疆邊境接壤的蒙古有幾篇關(guān)于馬屬動物巴貝斯蟲病流行的報道已發(fā)表[11，15-16]。這些研究表明在蒙古和Battsetseg等地的馬B.equi和B.caballi感染廣泛傳播[17]。據(jù)報道在蒙古Dermacentor nuttalli能夠傳播這兩種巴貝斯蟲。在流行地區(qū)控制可能的蜱媒被認(rèn)為減少感染和增加馬和驢的數(shù)量和質(zhì)量的一種有效方法?，F(xiàn)今對于新疆地區(qū)馬屬動物巴貝斯焦蟲病的蜱媒介仍是未知的，因此，迫切需要鑒定新疆地區(qū)涉及B.equi和 B.caballi傳播的潛在媒介。

總之，在馬上B.equi比B.caballi感染更為普遍，然而，在本研究中，在新疆西部驢B.equi（9.6%）感染的陽性率低于B.caballi（38.7%）。此時該原因仍然未知，需要做大規(guī)模流行病學(xué)研究來闡述這個問題。

在本研究中，所有被檢測的317份馬屬動物血清均采自本地區(qū)，表明equine babesiosis在該地區(qū)馬屬動物血清上呈地方流行性，需要設(shè)計更正式的流行病學(xué)研究以確定感染的群體動力學(xué)和可能的傳播媒介的角色。另外，所有血清學(xué)陽性的馬屬動物血清均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，自從這些馬屬動物血清不斷的接觸B.equi和 B.caballi感染，它們可能獲得了相對較高的免疫性。

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