任雅萍 薛泉宏 來(lái)航線

我國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)蘋(píng)果2 000萬(wàn)噸以上，蘋(píng)果汁加工中每年排出蘋(píng)果渣近300萬(wàn)噸，廢棄時(shí)造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。作為動(dòng)物飼料，其蛋白質(zhì)含量偏低，影響了其他成分的利用。因此采用特定工藝，通過(guò)微生物發(fā)酵提高蘋(píng)果渣中蛋白質(zhì)含量，將蘋(píng)果渣轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)飼料，是解決蘋(píng)果渣出路的重要途徑之一。在利用蘋(píng)果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的發(fā)酵工藝以及在提高果渣發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量等方面已進(jìn)行了一些研究。但單細(xì)胞蛋白發(fā)酵產(chǎn)物中除蛋白外還有多種酶、活性肽、游離氨基酸等對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)具有重要作用的活性成分，這方面的相關(guān)研究較少。本文以蘋(píng)果渣為原料，重點(diǎn)探索接菌、加氮及滅菌處理對(duì)其發(fā)酵蛋白飼料中幾種活性物質(zhì)的影響，旨在為蘋(píng)果渣單細(xì)胞蛋白發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

酵母菌（Yeast）、黑曲霉A8（Aspergillus niger A8）及米曲霉（Aspergillus oryzae）由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。

1.1.2 原料

干蘋(píng)果渣（自然條件下風(fēng)干），由乾縣海升果汁廠提供。發(fā)酵混合原料組成：原料A（蘋(píng)果渣∶尿素=19∶1）、原料B（蘋(píng)果渣∶油渣粉∶尿素=17∶2∶1）；發(fā)酵原料制備：干混合原料∶自來(lái)水=1∶2。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌懸液制備

向250 ml三角瓶中裝入50 ml PDA培養(yǎng)基滅菌，待冷凝后將活化好的酵母菌懸液1 ml接入該瓶中，用金屬刮鏟涂勻后于28℃下培養(yǎng)3 d，向瓶中加100 ml無(wú)菌水制得菌懸液，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板測(cè)定，其活菌數(shù)為4.0×109CFU/ml。

1.2.2 黑曲霉A8及米曲霉孢子懸液制備

按方法1.2.1將活化好的黑曲霉A8及米曲霉接入裝有PDA培養(yǎng)基的三角瓶，于28℃下培養(yǎng)5 d，向瓶中加100 ml無(wú)菌水制得孢子懸液，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板測(cè)定，其孢子數(shù)分別為8.7×108、1.1×109CFU/ml。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵

1.2.3.1 方案設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)發(fā)酵劑、滅菌方式及原料組成3個(gè)因素。發(fā)酵劑設(shè)不接菌（CK）、單接酵母菌（Y）、單接黑曲霉（H）、單接米曲霉（M）、酵母菌+黑曲霉（Y+H）、酵母菌+米曲霉（Y+M）6個(gè)處理。滅菌方式設(shè)自然發(fā)酵（CK，原料不滅菌）和滅菌發(fā)酵（原料121℃滅菌30 min）2個(gè)處理。原料組成：設(shè)原料A（蘋(píng)果渣+氮素）和原料B（蘋(píng)果渣+氮素+油渣）2種類(lèi)型。試驗(yàn)共24個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，以未發(fā)酵純果渣原料作為對(duì)照組。

1.2.3.2 試驗(yàn)方法

按照1.1.2中的比例配制發(fā)酵原料，然后分別稱(chēng)取48.5 g發(fā)酵原料于150 ml組培瓶中，121℃下滅菌30 min，冷卻至室溫，接入發(fā)酵劑（單菌接種量為5 ml，混菌各2.5 ml），用滅菌竹簽攪勻，28℃下培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后將樣品在45℃下鼓風(fēng)烘干并粉碎備用。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)測(cè)定

1.2.4.1 游離氨基酸含量測(cè)定

稱(chēng)樣品1.000 g于小三角瓶中，加蒸餾水20 ml，加蓋小漏斗在水浴鍋上沸浴，維持15 min；加飽和CaCl22 ml，100 g/l KH2PO44 ml，待出現(xiàn)白色絮凝物后，充分搖勻過(guò)濾，取濾液0.5 ml定容至50 ml，采用茚三酮比色法測(cè)定樣品中游離氨基酸含量。

1.2.4.2 活性肽含量測(cè)定

將1.2.4.1中的提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定樣品中活性肽含量。

1.2.4.3 水溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱(chēng)樣品0.500 g于小三角瓶中，加蒸餾水10 ml，加蓋小漏斗后在水浴鍋上沸浴，維持15 min，充分搖勻后過(guò)濾，將濾液稀釋適宜倍數(shù)后，采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定其水溶性蛋白質(zhì)的含量。

1.3 結(jié)果計(jì)算

游離氨基酸發(fā)酵增率（⊿f）、接菌增率（⊿i）和滅菌增率（⊿s）采用下式計(jì)算：

式中：Cck——分別表示未發(fā)酵、未接菌及未滅菌游離氨基酸含量(g/kg)；

Ci——分別為發(fā)酵、接菌和滅菌處理后游離氨基酸含量(g/kg)。

活性肽及水溶性蛋白質(zhì)的發(fā)酵增率、接菌增率及滅菌增率計(jì)算同游離氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量

2.1.1 自然發(fā)酵（見(jiàn)表1）

表1 自然發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量及其增率

由表1可以看出，在自然發(fā)酵條件下，原料A不接種發(fā)酵劑，單靠原料及空氣中微生物自然接種，蘋(píng)果渣的游離氨基酸含量?jī)H由5.43 g/kg提高到5.81 g/kg，發(fā)酵增率⊿f僅為7.0%，而接種黑曲霉、酵母菌+米曲霉、酵母菌、酵母菌+黑曲霉及米曲霉后，發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸含量較未發(fā)酵純果渣原料有提高，其發(fā)酵增率⊿f分別為63.4%、38.3%、22.1%、16.6%及16.4%；與不接種相比，接種引起的游離氨基酸增率⊿i為8.8%～52.7%。原料B與之類(lèi)似，特別是在接種酵母菌加米曲霉時(shí)，游離氨基酸含量的發(fā)酵增率⊿f及接種增率⊿i分別為126.3%及94.5%，即原料中加入油渣能大幅度提高酵母菌+米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸含量。

2.1.2 滅菌發(fā)酵（見(jiàn)表2）

表2 滅菌發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量及其增率

由表2可以看出，在滅菌條件下，發(fā)酵能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量。在原料A中，向蘋(píng)果渣接種各供試菌株所得發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量為7.31～14.54 g/kg，發(fā)酵引起的游離氨基酸增率⊿f為89.1%～167.8%，其中不接菌處理游離氨基酸的增率⊿f為34.6%，與固態(tài)發(fā)酵期間黑曲霉孢子落入并生長(zhǎng)有關(guān)（樣品烘干處理時(shí)在CK中發(fā)現(xiàn)有黑曲霉生長(zhǎng)）。在不同發(fā)酵劑處理中，接菌引起的游離氨基酸增率⊿i為40.5%～98.9%，其中接種酵母菌+米曲霉時(shí)游離氨基酸含量較對(duì)照增加98.9%，增幅明顯。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸含量高達(dá)10.06～17.96 g/kg，與未發(fā)酵原料相比，發(fā)酵增率⊿f為85.3%～230.8%，接菌引起的游離氨基酸增率⊿i為1.3%～78.5%，以黑曲霉接種處理接菌增率最高。

2.1.3 原料滅菌及添加油渣對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸含量的影響

由表1、表2比較及表2中的滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下，發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量均明顯大于未滅菌自然發(fā)酵。在原料A中，自然發(fā)酵與滅菌發(fā)酵產(chǎn)物的游離氨基酸含量分別為5.81～8.87 g/kg與7.31～14.54 g/kg，其滅菌增率⊿s為21.8%～115.4%，滅菌處理增幅明顯，說(shuō)明原料滅菌能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物游離氨基酸含量，原料B與原料A類(lèi)似。

此外，由表1、表2可以看出，在自然發(fā)酵的酵母菌+黑曲霉及酵母菌+米曲霉處理中，原料B發(fā)酵產(chǎn)物的游離氨基酸含量分別是原料A的1.5及1.6倍；在滅菌發(fā)酵中，單接黑曲霉、酵母菌+黑曲霉混接處理的游離氨基酸含量及發(fā)酵增率⊿f也呈現(xiàn)B原料高于A原料的趨勢(shì)。結(jié)果表明，向原料中添加油渣有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中的游離氨基酸含量及發(fā)酵增率。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量

2.2.1 自然發(fā)酵（見(jiàn)表3）

表3 自然發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量及其增率

由表3可以看出，原料A在不滅菌和不接種發(fā)酵劑的自然條件下，靠原料、空氣及原料中的微生物自然接種，可以使蘋(píng)果渣的活性肽含量由0.20 g/kg增加到0.30 g/kg，發(fā)酵增率⊿f為50.0%；接種酵母菌+米曲霉、酵母菌+黑曲霉、黑曲霉、米曲霉及酵母菌后，發(fā)酵產(chǎn)物中活性肽含量的發(fā)酵增率⊿f分別為195.0%、150.0%、145.0%、110.0%及95.0%;與不接種對(duì)照處理相比,接種引起的活性肽增率⊿i為30.0%～96.7%。原

料B與之類(lèi)似，特別是在接種酵母菌+米曲霉時(shí)，活性肽含量的發(fā)酵增率⊿f及接種增率⊿i分別為220.0%及73.0%，增幅明顯。

2.2.2 滅菌發(fā)酵(見(jiàn)表4)

表4 滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量及其增率

由表4看出，在滅菌發(fā)酵中，接菌處理能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量。在原料A中，向蘋(píng)果渣接種各供試菌株發(fā)酵產(chǎn)物中活性肽含量為0.64～0.82 g/kg，米曲霉、黑曲霉、米曲霉+酵母菌及黑曲霉+酵母菌處理與不接菌對(duì)照活性肽差異顯著；發(fā)酵引起的活性肽增率⊿f為105.0%～310.0%，其中不接菌處理活性肽的增率⊿f為105.0%；在不同發(fā)酵劑處理中，接菌導(dǎo)致的活性肽增率⊿i為56.1%～100.0%，其中接種酵母菌+黑曲霉混菌時(shí)活性肽含量較對(duì)照增加100.0%，增幅明顯。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中活性肽含量高達(dá)0.57～0.96 g/kg，發(fā)酵導(dǎo)致的增率⊿f為185.0%～380.0%，接菌引起的活性肽增率⊿i為38.6%～68.4%。

2.2.3 原料滅菌及添加油渣對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中活性肽含量的影響

由表4中滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物活性肽的含量均明顯大于自然發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量，原料A和原料B滅菌增率⊿s分別為27.1%～64.3%和25.0%～81.1%，說(shuō)明滅菌能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量。

由表3、表4可以看出，在未滅菌條件及滅菌條件下，原料B發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量與原料A差異不大，原料B的發(fā)酵增率略高于原料A。由此可見(jiàn)，原料中添加油渣對(duì)提高發(fā)酵產(chǎn)物活性肽含量及發(fā)酵增率有一定影響。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量

2.3.1 自然發(fā)酵（見(jiàn)表5）

表5 自然發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量及其增率

由表5可以看出，在自然發(fā)酵條件下，原料A不接種發(fā)酵劑，僅靠原料及空氣中的微生物自然接種，就可以使蘋(píng)果渣的水溶性蛋白質(zhì)含量由2.08 g/kg提高到2.54 g/kg，增率⊿f為22.1%；接種酵母菌+米曲霉、米曲霉、酵母菌+黑曲霉及黑曲霉后，發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性蛋白質(zhì)含量較未發(fā)酵純果渣分別提高172.6%、151.4%、119.2%及57.2%；與不接種對(duì)照處理相比，除接種酵母菌后水溶性蛋白質(zhì)含量較對(duì)照下降1.6%外，其余發(fā)酵劑接種引起的水溶性蛋白質(zhì)增率⊿i為28.7%～123.2%。原料B與之類(lèi)似，特別是在接種米曲霉（M）時(shí)，水溶性蛋白質(zhì)含量的發(fā)酵增率⊿f及接菌增率⊿i分別為230.3%及161.2%，增幅明顯。

2.3.2 滅菌發(fā)酵（見(jiàn)表6）

由表6可以看出，在滅菌發(fā)酵中，發(fā)酵能顯著增加產(chǎn)物中水溶蛋白含量。在原料A中，發(fā)酵導(dǎo)致的水溶性蛋白質(zhì)增率⊿f為130.3%～569.2%，其中不接菌處理水溶性蛋白質(zhì)的增率⊿f為130.3%，與固態(tài)發(fā)酵期間曲霉孢子落入并生長(zhǎng)有關(guān)。接菌處理能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量，向蘋(píng)果渣接種各供試菌株發(fā)酵所得水溶性蛋白質(zhì)含量為5.94～13.92 g/kg，與不接菌對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），接菌導(dǎo)致的水溶性蛋白質(zhì)增率⊿i為24.0%～190.6%，其中接種酵母菌+米曲霉時(shí)水溶性蛋白質(zhì)含量含量較對(duì)照增加190.6%，增幅明顯。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性蛋白質(zhì)含量為4.85～14.87 g/kg，增率⊿f為133.2%～614.9%；與不接菌對(duì)照組相比，接菌導(dǎo)致的水溶性蛋白質(zhì)增率⊿i為62.7%～206.6%，差異顯著（P＜0.05）。

表6 滅菌發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量及其增率

2.3.3 原料滅菌及添加油渣對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表6中滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)的含量均明顯大于自然發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量，原料A和原料B的滅菌增率⊿s分別為80.9%～230.3%和54.4%～323.6%，增幅明顯，說(shuō)明滅菌處理能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量。

由表5、表6可以看出，在自然及滅菌條件下，原料B與原料A發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量存在一定差異。在自然發(fā)酵中，單接酵母菌、米曲霉時(shí)，原料B中水溶性蛋白質(zhì)含量是原料A的1.4、1.3倍，滅菌發(fā)酵與之類(lèi)似。此外，滅菌發(fā)酵中原料B、原料A的發(fā)酵增率⊿f分別為133.2%～614.9%、130.3%～569.2%，即原料B的發(fā)酵增率高于原料A，表明原料中添加油渣有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性蛋白質(zhì)含量及發(fā)酵增率。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，以蘋(píng)果渣為主要原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中水溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸及活性肽含量；發(fā)酵產(chǎn)物中上述活性成分含量高低與發(fā)酵中微生物作用、原料組成、供試菌株種類(lèi)及滅菌處理等因素密切相關(guān)。

目前,動(dòng)物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)研究已經(jīng)由粗蛋白營(yíng)養(yǎng)研究、氨基酸營(yíng)養(yǎng)研究發(fā)展至肽營(yíng)養(yǎng)研究階段。已有研究表明，在動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的吸收與利用過(guò)程中，游離氨基酸是最直接的吸收形式，肽（尤其是小肽）也起到十分重要的作用。施用暉等報(bào)道，在蛋雞日糧中添加0.3%的大分子酪蛋白肽后，提高了蛋雞的產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)換效率；許金新等報(bào)道，通過(guò)肽與游離氨基酸吸收部位的互補(bǔ),可達(dá)到氨基酸的最優(yōu)攝取，小肽作為生理調(diào)節(jié)物在動(dòng)物的消化代謝中起著非常重要的作用。單體氨基酸能夠取代完整蛋白的數(shù)量是有限的,直接吸收較大分子肽也是必要的，因而可通過(guò)游離氨基酸及肽類(lèi)的添加來(lái)提高蛋白質(zhì)的吸收利用率。

目前，蘋(píng)果渣發(fā)酵蛋白飼料研究的重點(diǎn)是提高發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量，而對(duì)發(fā)酵飼料中游離氨基酸研究很少，尚無(wú)關(guān)于發(fā)酵飼料中活性肽的研究報(bào)道。本文重點(diǎn)研究了以蘋(píng)果渣為原料發(fā)酵所得發(fā)酵飼料中水溶性蛋白質(zhì)、活性肽及游離氨基酸含量及影響因素，其結(jié)果可為果渣發(fā)酵飼料工藝設(shè)計(jì)及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

文中提及的“水溶性蛋白質(zhì)”是指發(fā)酵產(chǎn)物沸水提取時(shí)，濾液中用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量；“活性肽”則指水溶性蛋白質(zhì)提取液加入沉淀劑，沉淀大分子真蛋白后濾液中殘留的小分子肽。鑒于目前尚無(wú)水溶性蛋白及活性肽的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，本研究暫將上述方法的測(cè)定結(jié)果定義為發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)及活性肽含量，其可行性有待進(jìn)一步研究確定。