魏紹巍，黎茵

廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275

PEPC是一種細(xì)胞質(zhì)酶，它以Mg2+或Mn2+為輔助因子，催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和HCO3-生成草酰乙酸 (OAA) 和無機磷酸的不可逆反應(yīng)。1953年，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC) 從菠菜葉中首次被分離出來，此后發(fā)現(xiàn)PEPC不僅廣泛存在于光合生物，如植物、藻類、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌中，還存在于很多非光合細(xì)菌和原生動物中[1-2]。

植物 PEPC具有多種生理功能，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：在C4和景天酸代謝 (CAM) 植物中作為C4二羧酸循環(huán)和景天酸代謝兩個代謝途徑的關(guān)鍵酶，起著固定大氣中CO2并作為CO2泵而提高光合效率的作用[3-4]；在C3植物中，它為Krebs循環(huán)補充四碳二羧酸從而調(diào)節(jié)回補反應(yīng)[5-6]；參與種子和果實的物質(zhì)合成和代謝，在種子發(fā)育和萌發(fā)，以及果實成熟方面有促進作用[5,7-8]；調(diào)節(jié)細(xì)胞pH，保持離子平衡，調(diào)節(jié)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的滲透壓及運動[2]；為豆科植物根瘤共生氮固定提供碳骨架[1-2]等等。

1 植物PEPC的種類與結(jié)構(gòu)

1.1 植物PEPC的種類和基因序列特征

PEPC多肽段的大小變化非常大，在高等植物中，PEPC主要以4種同工酶形式存在，即C4光合型、C3光合型、CAM型以及非光合型[9]。在大多數(shù)高等植物中存在著3~4個編碼PEPC的小ppc基因家族，每個家族包含 1個到多個基因。例如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的ppc基因有4個，在水稻和高粱中均發(fā)現(xiàn)6個，黃花菊屬植物Flaveria trinervia和甘蔗中發(fā)現(xiàn)3~4個，而在玉米、歐洲油菜和尖刺蓮子草中均發(fā)現(xiàn)3個。目前的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物ppc都含有1個非常保守的由10~11個外顯子和9~10個內(nèi)含子組成的結(jié)構(gòu)，外顯子和內(nèi)含子數(shù)目的差別在于一些ppc的5￠非翻譯區(qū)存在或缺失1個內(nèi)含子[2]。

從正在發(fā)育的蓖麻種子胚乳中發(fā)現(xiàn)兩類PEPC，其中Class-1 PEPC是一個典型的410 kDa大小的同源四聚體，每個亞基為 107 kDa；而Class-2 PEPC是大小為681 kDa的異源八聚體，包括相同的107 kDa亞基及與之連接但免疫反應(yīng)和結(jié)構(gòu)都無相關(guān)性的64 kDa的肽段[10]。從擬南芥基因組中鑒定出ppc基因家族有4個基因，其中3個具有高度相似性，第4個ppc基因編碼的PEPC大小與細(xì)菌PEPC相似，并且缺乏N端磷酸化位點，同時在水稻Oryza sativa中也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌型的PEPC[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，PEPC的線性序列顯示大約有100個殘基高度保守 (相同) 而且有另外100個殘基也是保守的 (相似)，因為C末端的高度保守，來源不同的PEPC長度的差異似乎是在N末端或內(nèi)部區(qū)域中添加或缺失額外序列引起的[1,12]。蔡小寧等通過對GenBank上登錄的PEPC的cDNA序列、氨基酸序列進行 Blast搜索，找到了 62個 PEPC蛋白質(zhì)序列，絕大多數(shù)屬于C3植物，9個屬于C4植物，比較發(fā)現(xiàn)62個PEPC蛋白的亞細(xì)胞定位基本一致，并且這62個PEPC蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性為86.70%，而其中19個C3PEPC和9個C4PEPC同源性分別為 89.63%和 89.61%，說明植物PEPC具有高度同源性[6]。

1.2 PEPC的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

目前所有已知的PEPC均是四聚體，4個相同亞基的分子量范圍為 95~110 kDa[12]。2002年Matsumura等發(fā)表了從玉米葉片中純化的結(jié)合了硫酸根離子的ZmPEPC蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，這是目前唯一報道的植物 PEPC的三維蛋白晶體結(jié)構(gòu)[12-13]。X-衍射分析發(fā)現(xiàn)ZmPEPC酶蛋白由4個相同的亞基組成“雙二聚體”構(gòu)型，排列成四方形，中間是 1個大空隙。二聚體中 2個單體的接觸面積較大，而 2個二聚體的接觸面積較小，這正好解釋了 ZmPEPC一旦被稀釋之后具有解離成二聚體的趨勢[1,13]。ZmPEPC單體由1個8股鏈的β桶形結(jié)構(gòu) (β barrel)和它周圍的42個α螺旋構(gòu)成，β鏈由40個氨基酸構(gòu)成；α螺旋由576個氨基酸構(gòu)成，α螺旋大部分集中在β桶的C末端，只有少部分在β桶的N末端[13]。高度保守的氨基酸殘基在β桶C末端區(qū)呈束狀排列，在外圍區(qū)域附近分散[1]。研究還發(fā)現(xiàn)ZmPEPC的催化活性位點位于β桶C末端區(qū)域，在催化位點中有4個精氨酸殘基 (Arg456、Arg647、Arg759和Arg773)與底物PEP結(jié)合，2個帶負(fù)電的氨基酸 (Glu566和Asp603) 與鎂離子結(jié)合，這些氨基酸在所有的PEPC中嚴(yán)格保守[2,12-13]。

生物學(xué)信息預(yù)測分析表明其他植物 PEPC的結(jié)構(gòu)與ZmPEPC類似。González等分析了小麥PEPC的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)小麥 PEPC單體二級結(jié)構(gòu)中預(yù)測的活性部位同樣是由β桶和較多的α螺旋構(gòu)成，相應(yīng)的活性部位有Arg457、Arg648、Arg760和Arg895等保守氨基酸殘基[14]。陳明娜等對堿蓬 PEPC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)以 α螺旋為主，占60.46%，無規(guī)則卷曲占35.61%，β折疊占3.93%；三級結(jié)構(gòu)呈緊密的球狀結(jié)構(gòu)；跨膜結(jié)構(gòu)域信號肽分析表明該蛋白不含信號肽，屬于非分泌性蛋白[15]。

2 植物組織中PEPC的活性調(diào)節(jié)

絕大多數(shù)的 PEPC是變構(gòu)酶，其變構(gòu)作用的調(diào)節(jié)過程往往與代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用相關(guān)[4,8]。雙子葉植物 PEPC的活性可被正調(diào)控代謝效應(yīng)物葡萄糖-6-磷酸 (G-6-P) 和丙糖磷酸等激活，并被負(fù)調(diào)控反饋抑制劑L-蘋果酸或Asp等抑制，同時單子葉植物PEPC活性還可被Gly或Ala激活[1,5]。另外，一些包含磷酸基的化合物以及有機酸或 PEP/丙酮酸的類似物還分別是常用的激活劑和抑制劑[16]。除此之外，C4植物 PEPC氨基端的 1個保守絲氨酸殘基還受到可逆磷酸化的調(diào)節(jié)[2]。植物細(xì)胞中的PEPC可被一種高水平底物專一性的Ca2+依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶——PEPC激酶 (PEPCK) 磷酸化[7,17]，但是修飾PEPC試驗以及RNAi或反義技術(shù)抑制PEPCK活性試驗暗示：至少對于C4植物光合PEPC來說，PEPCK對于提高光合效率并不具有重要的調(diào)節(jié)功能[2]。

引起 ppc基因的差別表達(dá)的可能因素還包括特化的細(xì)胞核因子、DNA甲基化和不同啟動子的存在[14]，因此ppc的表達(dá)也依賴于器官或細(xì)胞的類型、發(fā)育時期以及葉片的位置。所有的非 C4植物PEPC在C3植物葉片所有組織中通常表現(xiàn)為低水平表達(dá)，在C4植物進化過程中ppc的表達(dá)發(fā)生了改變，從而大大提高了表達(dá)水平[2,18]。對黃花菊屬 C4植物Flaveria trinervia光合ppc基因 (ppcA) 啟動子的研究支持了ppc表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的事實，這種C4啟動子包含2個區(qū)域，1個從起始位置到-570的近端片段 (PR) 和 1個從-1 566到-2 141的遠(yuǎn)端片段(DR)，這兩個區(qū)域是保持ppcA在葉肉細(xì)胞中高水平特異性表達(dá)的充分必要條件，PR和DR是作為一個加性的協(xié)同轉(zhuǎn)錄控制系統(tǒng)來起作用的。通過啟動子刪除和重組研究，發(fā)現(xiàn)DR包含1個41 bp的MEM1 (葉肉表達(dá)元件 1)，主要與亮氨酸拉鏈 (bZIP) 蛋白家族反式轉(zhuǎn)錄因子進行結(jié)合[18-19]。PEPC除受到體內(nèi)調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)之外，還受到光、溫度、pH、氮代謝、鹽及干旱等外界環(huán)境因子的影響[9,16]。

3 PEPC在基因工程中的應(yīng)用

3.1 提高作物光合效率

C4PEPC對其底物有較高的親合力，將C4光合關(guān)鍵酶基因?qū)?C3植物從而在重要的 C3作物中建立起 C4循環(huán)，提高光合生產(chǎn)能力一直是人們關(guān)注的問題[20]。Ku等首次將完整的玉米 C4型ppc轉(zhuǎn)入水稻中，體外測定表明PEPC活性增加110倍，植株中的PEPC蛋白含量占葉片總可溶蛋白的12%[21]，同時光呼吸有一定程度削弱，但光合速率未發(fā)生明顯變化。Bandyopadhyay等將完整的玉米ppc整合進秈稻中，觀察到在高溫下轉(zhuǎn)基因秈稻的光合速率得到了提高，但是產(chǎn)量并沒有變化[22]。方立鋒等對轉(zhuǎn)ppc水稻的研究結(jié)果表明，在旱作條件下，2個轉(zhuǎn) ppc株系單株產(chǎn)量分別比未轉(zhuǎn)基因的對照增加28%和42%，分蘗增加27%和40%；同時轉(zhuǎn)ppc水稻有較強的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力[23]。周寶元等對轉(zhuǎn)玉米 ppc水稻株系的研究發(fā)現(xiàn)，單純導(dǎo)入ppc并不能提高水稻的光合速率，而干旱脅迫下由于PEPC參與水稻的抗旱反應(yīng)而減輕了脅迫對光合作用的抑制[24]。向珣朝等發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景的轉(zhuǎn) ppc水稻材料在提高其凈光合速率方面表現(xiàn)不一致，但ppc單個基因的表達(dá)在不同保持系遺傳背景下能夠大幅度提高千粒重和單株產(chǎn)量[25]。張建福等對轉(zhuǎn)甘蔗 ppc秈稻進行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系的光合效率顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誟26]。陳緒清等將玉米ppc完全整合到小麥基因組中，測定發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株葉片中PEPC酶活性提高了3~5倍，光合速率有所提高，并且氣孔的開放程度與葉片中的 PEPC活性緊密相關(guān)，說明完整的玉米C4ppc在小麥中可以正確表達(dá)并起到一定的生理作用[27]。

由于C4循環(huán)是在多種酶和轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)同作用下完成的，增加個別基因的表達(dá)并不能在C3植物中建立完整的 C4循環(huán)，還可能擾亂 C3植物的正常代謝，因此目前的研究也嘗試將兩個或更多C4關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入同一種C3植物中[18]。袁定陽等將PEPC、PPDK (磷酸丙酮酸二激酶) 基因?qū)胨净謴?fù)系R299，PEPC酶活性和光合速率分析結(jié)果表明，其PEPC活性比對照提高了1.5~4.9倍，光合速率提高了19%~40%[28]。張邊江等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)PEPC+PPDK 雙基因水稻高表達(dá)了C4光合酶活性，在高光和高溫條件下，噴施外源ATP后，其光合能力增強，光氧化傷害減輕，產(chǎn)量明顯提高[29]。傅元婷等研究了轉(zhuǎn)PEPC+PPDK+ME (蘋果酸酶) 基因水稻 (PKM)的生理特性，結(jié)果表明，PKM水稻高表達(dá)了相關(guān)的C4光合酶，在高光和高溫條件下 PKM 水稻光合速率比原種提高55%以上，水稻耐光氧化能力進一步增強[30]。Taniguchi等通過建立水稻轉(zhuǎn)基因系研究了PEPC、PPDK、NADP-ME (NADP-蘋果酸酶) 和NADP-MDH (NADP-蘋果酸脫氫酶) 4種C4酶單獨或聯(lián)合在水稻葉肉細(xì)胞中超表達(dá)對水稻光合特性的影響，結(jié)果表明，聯(lián)合 4種酶的超表達(dá)在葉綠體中并不能濃縮CO2。同時發(fā)現(xiàn)PEPC和ME超表達(dá)導(dǎo)致輕微的發(fā)育遲緩，而超表達(dá) MDH可以緩和這種效應(yīng)[31]。

3.2 提高油料作物種子脂肪酸含量

PEPC是控制植物種子中蛋白質(zhì)和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一，抑制其活性可以提高植物體中脂肪酸的含量。PEPC在植物種子中參與種子貯藏蛋白和脂肪酸代謝的調(diào)控方面的功能引起了農(nóng)業(yè)界的關(guān)注[32-34]，當(dāng)PEPC的表達(dá)受到抑制時，PEPC通過改變代謝模式使碳原子的流向從糖類物質(zhì)的合成轉(zhuǎn)向脂肪酸的合成[35-37]。Kubis等對油菜種子的研究表明，種子質(zhì)體中的物質(zhì)代謝流向顯示碳原子通過形成多種中間代謝物經(jīng)質(zhì)體轉(zhuǎn)運蛋白進入質(zhì)體參與脂肪酸的合成 (圖1)[37]。陳錦清等研究發(fā)現(xiàn)反義ppc轉(zhuǎn)化油菜籽粒含油量比對照最高增加了 15%以上，蛋白質(zhì)含量與油脂含量呈顯著負(fù)相關(guān)，該研究證明了底物競爭調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)油脂比率的理論，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)多年選育得到超高油油菜轉(zhuǎn)基因品種[33]。其后在大豆、稻米等作物中應(yīng)用這一技術(shù)也得到了籽粒高油品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物[38-39]。說明 PEPC在作物種子中的調(diào)控能夠顯著改變種子的物質(zhì)代謝過程并且可以實際應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。彭苗苗等利用海島棉 ppc非保守序列的片段分別構(gòu)建了帶有種子特異性napin啟動子和α球蛋白B基因啟動子的PEPC-ihpRNA載體，為后期高含油量棉花材料的選育打下基礎(chǔ)[40]。范正琪等從能源植物麻瘋樹中克隆了 ppc基因全長 cDNA，并對其所編碼的氨基酸序列進行了生物信息學(xué)分析，為鑒定麻瘋樹 ppc基因功能和進一步培育高油麻瘋樹新品種奠定了前期基礎(chǔ)[41]。而潘昱名等利用 RT-PCR技術(shù)克隆花生ppc片段，構(gòu)建了由35S啟動子所控制的反義表達(dá)載體[34,42]。本實驗室也利用花生 ppc片段分別構(gòu)建了35S啟動子和花生油體蛋白種子特異啟動子[43]控制的 RNAi植物表達(dá)載體，并在煙草中進行了轉(zhuǎn)基因檢測，為獲得轉(zhuǎn)基因高油花生種質(zhì)提供基因和表達(dá)載體 (魏紹巍和黎茵，未發(fā)表資料)。

圖1 油料作物種子質(zhì)體中的物質(zhì)代謝流向[37]Fig. 1 Pathways of metabolic flux in plastids of oil seeds[37]. Glc6P: glucose 6-phosphate; DHAP: dihydroxyacetone phosphate; PEP: phosphoenolpyruvate; ac-CoA: acetyl-CoenzymeA; mal-CoA: malonyl-CoenzymeA; acyl-CoA: fatty acyl-CoA.

3.3 促進種子蛋白質(zhì)合成

在種子中，與抑制 PEPC表達(dá)促進脂肪酸的合成相反，提高 PEPC的表達(dá)可激活糖酵解過程中碳原子流向蛋白質(zhì)方向的分支代謝途徑[8,44]。在種子發(fā)育的早期和中期，子葉中 PEPC的表達(dá)量會明顯上升，它的活性通常被磷酸化所激活，并受到植物此時碳源和氮源供給的影響，種子發(fā)育后期蛋白質(zhì)合成基本完成后 PEPC的活性明顯下降，因而從一個側(cè)面反映了發(fā)育子葉中 PEPC對于蛋白合成當(dāng)中通過合成有機酸為氨基酸提供碳骨架的重要性[4,44-46]。Rolletschek等將谷氨酸棒桿菌的PEPC轉(zhuǎn)入豆科牧草法國野豌豆并使其在種子中特異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的種子中通過 CO2代謝進入種子蛋白的碳含量增加了3倍之多，雖然總糖含量有所下降，但轉(zhuǎn)基因種子中蛋白質(zhì)相對于種子干重的含量增加了20%，并且可能由于碳同化作用的提高，種子干重也增加了 20%~30%，在此基礎(chǔ)上，Rolletschek等總結(jié)得出了過量表達(dá) PEPC的轉(zhuǎn)基因植物種子中糖代謝途徑的可能調(diào)控途徑 (圖2)[8]。該研究還發(fā)現(xiàn)過量表達(dá) PEPC可促進豆球蛋白的積累，說明在轉(zhuǎn)基因植物中通過調(diào)控 PEPC的表達(dá)不僅提高豆類種子的蛋白含量，也使其中的一些組分發(fā)生變化[8]。張占琴等在油菜中的研究結(jié)果表明，PEPC活性直接影響了不同發(fā)育時期籽粒的油脂含量/蛋白含量比值，PEPC活性升高期間蛋白積累速度快于油脂，油脂含量/蛋白含量比值低，說明PEPC促進蛋白的合成，該研究對種子蛋白組分的分析結(jié)果也表明PEPC的活性與部分種子貯藏蛋白的積累變化有關(guān)[47]。因此利用 PEPC相關(guān)的生物工程途徑改變作物種子的蛋白合成模式并提高種子的品質(zhì)是完全可行且有效的[8,48]。

3.4 在微生物和藻類基因工程中的應(yīng)用

PEPC在種類繁多的微生物中也廣泛分布，并具有多重生物功能，是糖異生作用和氨基酸合成之間的重要紐帶[49]，因此也是許多微生物基因工程的調(diào)控靶標(biāo)。Lin等發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中同時過表達(dá)高粱ppc和乳酸菌pyc (丙酮酸羧化酶基因)，能夠有效提高具有化工利用價值的琥珀酸產(chǎn)量[50]。近年來微藻作為生物柴油生產(chǎn)原料越來越受到人們的關(guān)注。抑制PEPC活性有助于ACCase (乙酰輔酶A羧化酶)催化底物進入脂肪酸途徑，侯李君等在大腸桿菌中構(gòu)建了魚腥藻 ppc基因 (pepcA) 的正反義表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn) PEPC的過表達(dá)促進了蛋白質(zhì)的形成，抑制了脂類的合成；而下調(diào) PEPC的表達(dá)會促進脂類的合成，減少蛋白的合成[51]。宋東輝等開展了利用反義技術(shù)調(diào)控微藻 PEPC代謝途徑的工作，初步結(jié)果表明，反義抑制 PEPC酶活性可顯著提高微藻細(xì)胞中脂類物質(zhì)的含量[52]。

圖2 PEPC轉(zhuǎn)基因植物種子中糖代謝途徑的調(diào)控[8]Fig. 2 Proposed changes in the metabolic pathway of carbonhydrates in PEPC transgenic seeds[8]. Metabolites which are decreased are given in red. Metabolites which are increased are shown in green. ADPG: adenosine diphosphate glucose; ATP, adenosine triphosphate; F6P: fructose-6-phosphate; F1,6P2: fructose-1,6-bisphosphate; G1P: glucose-1-phosphate; G3P: glucose-3-phosphate; G6P: glucose-6-phosphate; OAA: oxaloacetate; 3PGA: 3-phospho-glycetate; UDPG: uridine diphosphate glucose.

4 展望

植物 PEPC的結(jié)構(gòu)特點以及在植物細(xì)胞中參與的代謝途徑已有深入的研究，其生理生化機制在分子水平上也逐步得到闡明。ppc基因的來源、功能、遺傳操作等研究取得的成果，為利用 PEPC調(diào)控改良作物碳同化途徑、提高油料作物和蛋白來源種子作物營養(yǎng)品質(zhì)提供了理論和實踐基礎(chǔ)，也為能源植物和微生物基因工程的應(yīng)用展現(xiàn)了很好的前景。本實驗室的部分研究結(jié)果也顯示，PEPC在植物中尤其是葉片組織細(xì)胞中的表達(dá)會受到多種因素調(diào)節(jié)，從而直接影響碳同化的效率，整體降低 PEPC的表達(dá)水平會對植物的代謝和生長造成影響，因此應(yīng)考慮采用組織特異表達(dá)的方式來下調(diào) PEPC表達(dá)，促進脂肪酸合成。而整體水平上大量提高 PEPC的表達(dá)則有可能同時提高植物的干物質(zhì)總量、蛋白質(zhì)含量和抗脅迫能力，從而達(dá)到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的。

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