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        植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的應用

        2011-02-09 09:36:44魏紹巍黎茵
        生物工程學報 2011年12期
        關鍵詞:丙酮酸反義轉(zhuǎn)基因

        魏紹巍,黎茵

        廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室 中山大學生命科學學院,廣州 510275

        PEPC是一種細胞質(zhì)酶,它以Mg2+或Mn2+為輔助因子,催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和HCO3-生成草酰乙酸 (OAA) 和無機磷酸的不可逆反應。1953年,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC) 從菠菜葉中首次被分離出來,此后發(fā)現(xiàn)PEPC不僅廣泛存在于光合生物,如植物、藻類、藍細菌和光合細菌中,還存在于很多非光合細菌和原生動物中[1-2]。

        植物 PEPC具有多種生理功能,主要體現(xiàn)在以下幾個方面:在C4和景天酸代謝 (CAM) 植物中作為C4二羧酸循環(huán)和景天酸代謝兩個代謝途徑的關鍵酶,起著固定大氣中CO2并作為CO2泵而提高光合效率的作用[3-4];在C3植物中,它為Krebs循環(huán)補充四碳二羧酸從而調(diào)節(jié)回補反應[5-6];參與種子和果實的物質(zhì)合成和代謝,在種子發(fā)育和萌發(fā),以及果實成熟方面有促進作用[5,7-8];調(diào)節(jié)細胞pH,保持離子平衡,調(diào)節(jié)氣孔保衛(wèi)細胞的滲透壓及運動[2];為豆科植物根瘤共生氮固定提供碳骨架[1-2]等等。

        1 植物PEPC的種類與結(jié)構

        1.1 植物PEPC的種類和基因序列特征

        PEPC多肽段的大小變化非常大,在高等植物中,PEPC主要以4種同工酶形式存在,即C4光合型、C3光合型、CAM型以及非光合型[9]。在大多數(shù)高等植物中存在著3~4個編碼PEPC的小ppc基因家族,每個家族包含 1個到多個基因。例如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的ppc基因有4個,在水稻和高粱中均發(fā)現(xiàn)6個,黃花菊屬植物Flaveria trinervia和甘蔗中發(fā)現(xiàn)3~4個,而在玉米、歐洲油菜和尖刺蓮子草中均發(fā)現(xiàn)3個。目前的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物ppc都含有1個非常保守的由10~11個外顯子和9~10個內(nèi)含子組成的結(jié)構,外顯子和內(nèi)含子數(shù)目的差別在于一些ppc的5¢非翻譯區(qū)存在或缺失1個內(nèi)含子[2]。

        從正在發(fā)育的蓖麻種子胚乳中發(fā)現(xiàn)兩類PEPC,其中Class-1 PEPC是一個典型的410 kDa大小的同源四聚體,每個亞基為 107 kDa;而Class-2 PEPC是大小為681 kDa的異源八聚體,包括相同的107 kDa亞基及與之連接但免疫反應和結(jié)構都無相關性的64 kDa的肽段[10]。從擬南芥基因組中鑒定出ppc基因家族有4個基因,其中3個具有高度相似性,第4個ppc基因編碼的PEPC大小與細菌PEPC相似,并且缺乏N端磷酸化位點,同時在水稻Oryza sativa中也發(fā)現(xiàn)了細菌型的PEPC[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),PEPC的線性序列顯示大約有100個殘基高度保守 (相同) 而且有另外100個殘基也是保守的 (相似),因為C末端的高度保守,來源不同的PEPC長度的差異似乎是在N末端或內(nèi)部區(qū)域中添加或缺失額外序列引起的[1,12]。蔡小寧等通過對GenBank上登錄的PEPC的cDNA序列、氨基酸序列進行 Blast搜索,找到了 62個 PEPC蛋白質(zhì)序列,絕大多數(shù)屬于C3植物,9個屬于C4植物,比較發(fā)現(xiàn)62個PEPC蛋白的亞細胞定位基本一致,并且這62個PEPC蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性為86.70%,而其中19個C3PEPC和9個C4PEPC同源性分別為 89.63%和 89.61%,說明植物PEPC具有高度同源性[6]。

        1.2 PEPC的蛋白質(zhì)結(jié)構

        目前所有已知的PEPC均是四聚體,4個相同亞基的分子量范圍為 95~110 kDa[12]。2002年Matsumura等發(fā)表了從玉米葉片中純化的結(jié)合了硫酸根離子的ZmPEPC蛋白質(zhì)晶體結(jié)構,這是目前唯一報道的植物 PEPC的三維蛋白晶體結(jié)構[12-13]。X-衍射分析發(fā)現(xiàn)ZmPEPC酶蛋白由4個相同的亞基組成“雙二聚體”構型,排列成四方形,中間是 1個大空隙。二聚體中 2個單體的接觸面積較大,而 2個二聚體的接觸面積較小,這正好解釋了 ZmPEPC一旦被稀釋之后具有解離成二聚體的趨勢[1,13]。ZmPEPC單體由1個8股鏈的β桶形結(jié)構 (β barrel)和它周圍的42個α螺旋構成,β鏈由40個氨基酸構成;α螺旋由576個氨基酸構成,α螺旋大部分集中在β桶的C末端,只有少部分在β桶的N末端[13]。高度保守的氨基酸殘基在β桶C末端區(qū)呈束狀排列,在外圍區(qū)域附近分散[1]。研究還發(fā)現(xiàn)ZmPEPC的催化活性位點位于β桶C末端區(qū)域,在催化位點中有4個精氨酸殘基 (Arg456、Arg647、Arg759和Arg773)與底物PEP結(jié)合,2個帶負電的氨基酸 (Glu566和Asp603) 與鎂離子結(jié)合,這些氨基酸在所有的PEPC中嚴格保守[2,12-13]。

        生物學信息預測分析表明其他植物 PEPC的結(jié)構與ZmPEPC類似。González等分析了小麥PEPC的蛋白結(jié)構,發(fā)現(xiàn)小麥 PEPC單體二級結(jié)構中預測的活性部位同樣是由β桶和較多的α螺旋構成,相應的活性部位有Arg457、Arg648、Arg760和Arg895等保守氨基酸殘基[14]。陳明娜等對堿蓬 PEPC蛋白質(zhì)結(jié)構預測結(jié)果顯示,二級結(jié)構以 α螺旋為主,占60.46%,無規(guī)則卷曲占35.61%,β折疊占3.93%;三級結(jié)構呈緊密的球狀結(jié)構;跨膜結(jié)構域信號肽分析表明該蛋白不含信號肽,屬于非分泌性蛋白[15]。

        2 植物組織中PEPC的活性調(diào)節(jié)

        絕大多數(shù)的 PEPC是變構酶,其變構作用的調(diào)節(jié)過程往往與代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用相關[4,8]。雙子葉植物 PEPC的活性可被正調(diào)控代謝效應物葡萄糖-6-磷酸 (G-6-P) 和丙糖磷酸等激活,并被負調(diào)控反饋抑制劑L-蘋果酸或Asp等抑制,同時單子葉植物PEPC活性還可被Gly或Ala激活[1,5]。另外,一些包含磷酸基的化合物以及有機酸或 PEP/丙酮酸的類似物還分別是常用的激活劑和抑制劑[16]。除此之外,C4植物 PEPC氨基端的 1個保守絲氨酸殘基還受到可逆磷酸化的調(diào)節(jié)[2]。植物細胞中的PEPC可被一種高水平底物專一性的Ca2+依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶——PEPC激酶 (PEPCK) 磷酸化[7,17],但是修飾PEPC試驗以及RNAi或反義技術抑制PEPCK活性試驗暗示:至少對于C4植物光合PEPC來說,PEPCK對于提高光合效率并不具有重要的調(diào)節(jié)功能[2]。

        引起 ppc基因的差別表達的可能因素還包括特化的細胞核因子、DNA甲基化和不同啟動子的存在[14],因此ppc的表達也依賴于器官或細胞的類型、發(fā)育時期以及葉片的位置。所有的非 C4植物PEPC在C3植物葉片所有組織中通常表現(xiàn)為低水平表達,在C4植物進化過程中ppc的表達發(fā)生了改變,從而大大提高了表達水平[2,18]。對黃花菊屬 C4植物Flaveria trinervia光合ppc基因 (ppcA) 啟動子的研究支持了ppc表達受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的事實,這種C4啟動子包含2個區(qū)域,1個從起始位置到-570的近端片段 (PR) 和 1個從-1 566到-2 141的遠端片段(DR),這兩個區(qū)域是保持ppcA在葉肉細胞中高水平特異性表達的充分必要條件,PR和DR是作為一個加性的協(xié)同轉(zhuǎn)錄控制系統(tǒng)來起作用的。通過啟動子刪除和重組研究,發(fā)現(xiàn)DR包含1個41 bp的MEM1 (葉肉表達元件 1),主要與亮氨酸拉鏈 (bZIP) 蛋白家族反式轉(zhuǎn)錄因子進行結(jié)合[18-19]。PEPC除受到體內(nèi)調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)之外,還受到光、溫度、pH、氮代謝、鹽及干旱等外界環(huán)境因子的影響[9,16]。

        3 PEPC在基因工程中的應用

        3.1 提高作物光合效率

        C4PEPC對其底物有較高的親合力,將C4光合關鍵酶基因?qū)?C3植物從而在重要的 C3作物中建立起 C4循環(huán),提高光合生產(chǎn)能力一直是人們關注的問題[20]。Ku等首次將完整的玉米 C4型ppc轉(zhuǎn)入水稻中,體外測定表明PEPC活性增加110倍,植株中的PEPC蛋白含量占葉片總可溶蛋白的12%[21],同時光呼吸有一定程度削弱,但光合速率未發(fā)生明顯變化。Bandyopadhyay等將完整的玉米ppc整合進秈稻中,觀察到在高溫下轉(zhuǎn)基因秈稻的光合速率得到了提高,但是產(chǎn)量并沒有變化[22]。方立鋒等對轉(zhuǎn)ppc水稻的研究結(jié)果表明,在旱作條件下,2個轉(zhuǎn) ppc株系單株產(chǎn)量分別比未轉(zhuǎn)基因的對照增加28%和42%,分蘗增加27%和40%;同時轉(zhuǎn)ppc水稻有較強的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力[23]。周寶元等對轉(zhuǎn)玉米 ppc水稻株系的研究發(fā)現(xiàn),單純導入ppc并不能提高水稻的光合速率,而干旱脅迫下由于PEPC參與水稻的抗旱反應而減輕了脅迫對光合作用的抑制[24]。向珣朝等發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景的轉(zhuǎn) ppc水稻材料在提高其凈光合速率方面表現(xiàn)不一致,但ppc單個基因的表達在不同保持系遺傳背景下能夠大幅度提高千粒重和單株產(chǎn)量[25]。張建福等對轉(zhuǎn)甘蔗 ppc秈稻進行分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系的光合效率顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誟26]。陳緒清等將玉米ppc完全整合到小麥基因組中,測定發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株葉片中PEPC酶活性提高了3~5倍,光合速率有所提高,并且氣孔的開放程度與葉片中的 PEPC活性緊密相關,說明完整的玉米C4ppc在小麥中可以正確表達并起到一定的生理作用[27]。

        由于C4循環(huán)是在多種酶和轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)同作用下完成的,增加個別基因的表達并不能在C3植物中建立完整的 C4循環(huán),還可能擾亂 C3植物的正常代謝,因此目前的研究也嘗試將兩個或更多C4關鍵酶基因轉(zhuǎn)入同一種C3植物中[18]。袁定陽等將PEPC、PPDK (磷酸丙酮酸二激酶) 基因?qū)胨净謴拖礡299,PEPC酶活性和光合速率分析結(jié)果表明,其PEPC活性比對照提高了1.5~4.9倍,光合速率提高了19%~40%[28]。張邊江等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)PEPC+PPDK 雙基因水稻高表達了C4光合酶活性,在高光和高溫條件下,噴施外源ATP后,其光合能力增強,光氧化傷害減輕,產(chǎn)量明顯提高[29]。傅元婷等研究了轉(zhuǎn)PEPC+PPDK+ME (蘋果酸酶) 基因水稻 (PKM)的生理特性,結(jié)果表明,PKM水稻高表達了相關的C4光合酶,在高光和高溫條件下 PKM 水稻光合速率比原種提高55%以上,水稻耐光氧化能力進一步增強[30]。Taniguchi等通過建立水稻轉(zhuǎn)基因系研究了PEPC、PPDK、NADP-ME (NADP-蘋果酸酶) 和NADP-MDH (NADP-蘋果酸脫氫酶) 4種C4酶單獨或聯(lián)合在水稻葉肉細胞中超表達對水稻光合特性的影響,結(jié)果表明,聯(lián)合 4種酶的超表達在葉綠體中并不能濃縮CO2。同時發(fā)現(xiàn)PEPC和ME超表達導致輕微的發(fā)育遲緩,而超表達 MDH可以緩和這種效應[31]。

        3.2 提高油料作物種子脂肪酸含量

        PEPC是控制植物種子中蛋白質(zhì)和脂肪酸合成的關鍵酶之一,抑制其活性可以提高植物體中脂肪酸的含量。PEPC在植物種子中參與種子貯藏蛋白和脂肪酸代謝的調(diào)控方面的功能引起了農(nóng)業(yè)界的關注[32-34],當PEPC的表達受到抑制時,PEPC通過改變代謝模式使碳原子的流向從糖類物質(zhì)的合成轉(zhuǎn)向脂肪酸的合成[35-37]。Kubis等對油菜種子的研究表明,種子質(zhì)體中的物質(zhì)代謝流向顯示碳原子通過形成多種中間代謝物經(jīng)質(zhì)體轉(zhuǎn)運蛋白進入質(zhì)體參與脂肪酸的合成 (圖1)[37]。陳錦清等研究發(fā)現(xiàn)反義ppc轉(zhuǎn)化油菜籽粒含油量比對照最高增加了 15%以上,蛋白質(zhì)含量與油脂含量呈顯著負相關,該研究證明了底物競爭調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)油脂比率的理論,并在此基礎上經(jīng)多年選育得到超高油油菜轉(zhuǎn)基因品種[33]。其后在大豆、稻米等作物中應用這一技術也得到了籽粒高油品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物[38-39]。說明 PEPC在作物種子中的調(diào)控能夠顯著改變種子的物質(zhì)代謝過程并且可以實際應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當中。彭苗苗等利用海島棉 ppc非保守序列的片段分別構建了帶有種子特異性napin啟動子和α球蛋白B基因啟動子的PEPC-ihpRNA載體,為后期高含油量棉花材料的選育打下基礎[40]。范正琪等從能源植物麻瘋樹中克隆了 ppc基因全長 cDNA,并對其所編碼的氨基酸序列進行了生物信息學分析,為鑒定麻瘋樹 ppc基因功能和進一步培育高油麻瘋樹新品種奠定了前期基礎[41]。而潘昱名等利用 RT-PCR技術克隆花生ppc片段,構建了由35S啟動子所控制的反義表達載體[34,42]。本實驗室也利用花生 ppc片段分別構建了35S啟動子和花生油體蛋白種子特異啟動子[43]控制的 RNAi植物表達載體,并在煙草中進行了轉(zhuǎn)基因檢測,為獲得轉(zhuǎn)基因高油花生種質(zhì)提供基因和表達載體 (魏紹巍和黎茵,未發(fā)表資料)。

        圖1 油料作物種子質(zhì)體中的物質(zhì)代謝流向[37]Fig. 1 Pathways of metabolic flux in plastids of oil seeds[37]. Glc6P: glucose 6-phosphate; DHAP: dihydroxyacetone phosphate; PEP: phosphoenolpyruvate; ac-CoA: acetyl-CoenzymeA; mal-CoA: malonyl-CoenzymeA; acyl-CoA: fatty acyl-CoA.

        3.3 促進種子蛋白質(zhì)合成

        在種子中,與抑制 PEPC表達促進脂肪酸的合成相反,提高 PEPC的表達可激活糖酵解過程中碳原子流向蛋白質(zhì)方向的分支代謝途徑[8,44]。在種子發(fā)育的早期和中期,子葉中 PEPC的表達量會明顯上升,它的活性通常被磷酸化所激活,并受到植物此時碳源和氮源供給的影響,種子發(fā)育后期蛋白質(zhì)合成基本完成后 PEPC的活性明顯下降,因而從一個側(cè)面反映了發(fā)育子葉中 PEPC對于蛋白合成當中通過合成有機酸為氨基酸提供碳骨架的重要性[4,44-46]。Rolletschek等將谷氨酸棒桿菌的PEPC轉(zhuǎn)入豆科牧草法國野豌豆并使其在種子中特異表達,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的種子中通過 CO2代謝進入種子蛋白的碳含量增加了3倍之多,雖然總糖含量有所下降,但轉(zhuǎn)基因種子中蛋白質(zhì)相對于種子干重的含量增加了20%,并且可能由于碳同化作用的提高,種子干重也增加了 20%~30%,在此基礎上,Rolletschek等總結(jié)得出了過量表達 PEPC的轉(zhuǎn)基因植物種子中糖代謝途徑的可能調(diào)控途徑 (圖2)[8]。該研究還發(fā)現(xiàn)過量表達 PEPC可促進豆球蛋白的積累,說明在轉(zhuǎn)基因植物中通過調(diào)控 PEPC的表達不僅提高豆類種子的蛋白含量,也使其中的一些組分發(fā)生變化[8]。張占琴等在油菜中的研究結(jié)果表明,PEPC活性直接影響了不同發(fā)育時期籽粒的油脂含量/蛋白含量比值,PEPC活性升高期間蛋白積累速度快于油脂,油脂含量/蛋白含量比值低,說明PEPC促進蛋白的合成,該研究對種子蛋白組分的分析結(jié)果也表明PEPC的活性與部分種子貯藏蛋白的積累變化有關[47]。因此利用 PEPC相關的生物工程途徑改變作物種子的蛋白合成模式并提高種子的品質(zhì)是完全可行且有效的[8,48]。

        3.4 在微生物和藻類基因工程中的應用

        PEPC在種類繁多的微生物中也廣泛分布,并具有多重生物功能,是糖異生作用和氨基酸合成之間的重要紐帶[49],因此也是許多微生物基因工程的調(diào)控靶標。Lin等發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中同時過表達高粱ppc和乳酸菌pyc (丙酮酸羧化酶基因),能夠有效提高具有化工利用價值的琥珀酸產(chǎn)量[50]。近年來微藻作為生物柴油生產(chǎn)原料越來越受到人們的關注。抑制PEPC活性有助于ACCase (乙酰輔酶A羧化酶)催化底物進入脂肪酸途徑,侯李君等在大腸桿菌中構建了魚腥藻 ppc基因 (pepcA) 的正反義表達載體,發(fā)現(xiàn) PEPC的過表達促進了蛋白質(zhì)的形成,抑制了脂類的合成;而下調(diào) PEPC的表達會促進脂類的合成,減少蛋白的合成[51]。宋東輝等開展了利用反義技術調(diào)控微藻 PEPC代謝途徑的工作,初步結(jié)果表明,反義抑制 PEPC酶活性可顯著提高微藻細胞中脂類物質(zhì)的含量[52]。

        圖2 PEPC轉(zhuǎn)基因植物種子中糖代謝途徑的調(diào)控[8]Fig. 2 Proposed changes in the metabolic pathway of carbonhydrates in PEPC transgenic seeds[8]. Metabolites which are decreased are given in red. Metabolites which are increased are shown in green. ADPG: adenosine diphosphate glucose; ATP, adenosine triphosphate; F6P: fructose-6-phosphate; F1,6P2: fructose-1,6-bisphosphate; G1P: glucose-1-phosphate; G3P: glucose-3-phosphate; G6P: glucose-6-phosphate; OAA: oxaloacetate; 3PGA: 3-phospho-glycetate; UDPG: uridine diphosphate glucose.

        4 展望

        植物 PEPC的結(jié)構特點以及在植物細胞中參與的代謝途徑已有深入的研究,其生理生化機制在分子水平上也逐步得到闡明。ppc基因的來源、功能、遺傳操作等研究取得的成果,為利用 PEPC調(diào)控改良作物碳同化途徑、提高油料作物和蛋白來源種子作物營養(yǎng)品質(zhì)提供了理論和實踐基礎,也為能源植物和微生物基因工程的應用展現(xiàn)了很好的前景。本實驗室的部分研究結(jié)果也顯示,PEPC在植物中尤其是葉片組織細胞中的表達會受到多種因素調(diào)節(jié),從而直接影響碳同化的效率,整體降低 PEPC的表達水平會對植物的代謝和生長造成影響,因此應考慮采用組織特異表達的方式來下調(diào) PEPC表達,促進脂肪酸合成。而整體水平上大量提高 PEPC的表達則有可能同時提高植物的干物質(zhì)總量、蛋白質(zhì)含量和抗脅迫能力,從而達到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的。

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