李瑋 肖雄箭 林建東

臨床上，不管是在成人、兒童或新生兒中，膿毒癥是導(dǎo)致死亡的常見因素，其復(fù)雜的發(fā)病過程和病理生理變化，可能和機(jī)體免疫、代謝失調(diào)、心血管系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)[1-2]。在膿毒癥所致的難治性低血壓和多器官功能不全中，有10％～20％的患者存在嚴(yán)重的心肌功能障礙，其機(jī)制可能和心肌缺血、缺氧、炎癥介質(zhì)釋放等有關(guān)。心功能障礙時(shí)心肌細(xì)胞的生理改變?yōu)槟芰抗┙o之間的失衡，表現(xiàn)為以高能磷酸鹽含量減少為特征的能量不足。本研究應(yīng)用盲腸穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，通過觀察磷酸肌酸鈉對心肌細(xì)胞葡萄糖6-磷酸酶活性及心肌腺苷酸水平的影響，結(jié)合心肌超微結(jié)構(gòu)改變，探討磷酸肌酸鈉對膿毒癥心功能障礙的治療作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制備 健康SD大鼠30只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），體重200～250g，雌雄不限，隨機(jī)分為3組：（1）假手術(shù)組（A組，n=10），不進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù),于假手術(shù)前1h腹腔注射1m l的生理鹽水；（2）膿毒癥組（B組，n=10），于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前1h注射1m l的生理鹽水；（3）磷酸肌酸鈉組（C組，n=10），于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前1h腹腔注射磷酸肌酸鈉100mg/kg（1m l）。

假手術(shù)組動(dòng)物只開腹、關(guān)腹與復(fù)蘇，不結(jié)扎、不穿孔盲腸。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（caecum ligation per foration，CLP）制備ALI動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)[3]，術(shù)畢立即皮下注射50m l/kg林格氏液抗休克。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剖開胸腔，暴露心臟，快速取兩塊心肌組織（各約1cm3和1mm3），用于檢測葡萄糖6-磷酸酶的活性及透射電鏡觀察。同時(shí)用液氮保存的鋁夾在心臟原位冰凍，取組織100m g，置于液氮中低溫保存，高效液相色譜法檢測腺苷酸水平。

1.2 葡萄糖6-磷酸酶活性的半定量檢測 取1cm3組織塊于2.5％戊二醛溶液與二甲砷酸緩沖液中固定3h，按要求制備切片待檢，用日產(chǎn)LUZEX-F分析儀鏡檢及半定量分析，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)茶褐色硫化鉛沉淀分布的總面積大小進(jìn)行半定量檢測葡萄糖6-磷酸酶的活性。

1.3 ATP、ADP和AMP含量測定 高效液相色譜儀由美國Waters公司生產(chǎn)，ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品由美國Sigma公司提供。預(yù)柱為Nova.pakC18，色譜柱為Nova-pakC 18（3.9mm×150mm），按要求專人正確操作。將ATP、ADP和AM P標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.01mmol/L，0.02mmo1/L，0.0625mmol/L和0.125mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，取20μl進(jìn)樣，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。使標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。將樣品ATP、ADP和AMP獲得的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積相比，計(jì)算出樣品ATP、ADP和AMP的含量。

1.4 心肌細(xì)胞透射電鏡檢查 取1mm3心肌組織塊常規(guī)固化，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，超薄切片，在日立Hu-12A型透射電鏡下觀察。

表1 各組大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量測定值±s，n=10）

表1 各組大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量測定值±s，n=10）

注：*與假手術(shù)組比較P＜0.01；△與膿毒癥組比較P＜0.01

組別 G-6-PD（％） ATP（μmol/g） ADP（μmol/g） AMP（μmol/g）假手術(shù)組（A組） 2.51±0.85 2.69±0.81 4.18±0.49 4.85±0.61膿毒癥組（B組） 1.24±1.42* 1.36±0.40* 2.23±0.35* 3.14±0.52*磷酸肌酸組（C組） 1.90±0.54△ 2.01±0.42△ 3.96±0.50△ 5.06±0.72△

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖6-磷酸酶的組織化學(xué)檢測 膿毒癥組與假手術(shù)組比較，葡萄糖6-磷酸酶活性明顯降低，而經(jīng)磷酸肌酸處理后則明顯升高（P＜0.01）,見表1。

2.2 心肌ATP、ADP和AM P含量測定 膿毒癥組的心肌ATP、ADP和AMP含量明顯低于假手術(shù)組（P均＜0.01），經(jīng)磷酸肌酸處理后含量明顯升高（P均＜0.01），見表1。

2.3 心肌細(xì)胞透射電鏡檢查 電鏡下見假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，線粒體無腫脹，嵴排列整齊，心肌纖維排列規(guī)則。膿毒癥組線粒體減少，腫脹變形，外膜不清，空泡化，核糖體脫顆粒，嵴減少或消失，排列紊亂。肌絲、股節(jié)結(jié)構(gòu)斷裂缺失，核膜破裂，細(xì)胞基質(zhì)稀少。磷酸肌酸組病變較膿毒癥組減輕，線粒體腫脹較輕，膜尚完整，嵴略稀疏，部分線粒體破壞，排列仍規(guī)則，肌絲結(jié)構(gòu)排列尚規(guī)則。

3 討論

在臨床上，心肌細(xì)胞損傷及功能障礙是膿毒癥常見的并發(fā)癥，心功能障礙又會(huì)加劇膿毒癥病情且是影響膿毒癥預(yù)后的重要因素[4]。心肌細(xì)胞能量代謝障礙在心功能障礙和心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)重建中發(fā)揮重要作用。能量的生成分為有氧氧化和無氧酵解，有氧氧化要在線粒體中完成，而無氧酵解主要在胞漿中進(jìn)行。有氧氧化反應(yīng)過程是從胞漿進(jìn)入線粒體才完成的，葡萄糖6-磷酸酶是糖異生反應(yīng)的限速酶之一，它存在于胞漿中，該酶活性反映了糖異生變化。ATP是維持心肌細(xì)胞泵血功能必需的物質(zhì)，因?yàn)樵谛呐K組織中儲存的ATP遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足心肌細(xì)胞收縮和舒張之需要，所以，心肌細(xì)胞心須不斷合成ATP以保持心肌細(xì)胞的有效功能。研究證實(shí)，在內(nèi)毒素注射后1h[5]，大鼠心肌細(xì)胞G-6-PD活性增強(qiáng)，提示糖異生反應(yīng)增強(qiáng)；注射后3小時(shí)，該酶的活性明顯下降，提示糖異生減弱。膿毒癥早期，機(jī)體處于高代謝狀態(tài)，組織細(xì)胞需氧量增多，而實(shí)際上因?yàn)榇嬖谖⒀h(huán)障礙及組織利用氧障礙等因素，組織獲取氧量減少。因此，組織通過有氧氧化而生成的ATP減少。機(jī)體為了增加ATP的生成，必然增強(qiáng)無氧酵解。本實(shí)驗(yàn)中，因膿毒癥引起心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，線粒體腫脹、破壞，有氧氧化減弱，ATP、ADP和AM P生成減少。隨著能量物質(zhì)及其底物的消耗和線粒體功能結(jié)構(gòu)的改變，胞漿中酶的含量和活性也發(fā)生了變化，G-6-PD活性下降，糖異生減弱，更進(jìn)一步加快能量耗竭。

在心臟組織中，磷酸肌酸（Creatine Phosphate,CP）是最主要的能量合成底物，可生成細(xì)胞代謝所需的能源物質(zhì)—三磷酸腺苷（ATP），并在線粒體到細(xì)胞質(zhì)的能量運(yùn)輸與分配中起著重要的作用。心肌損傷時(shí)所消耗的ATP要靠CP轉(zhuǎn)化來補(bǔ)充，所以，損傷時(shí)CP也同樣大量消耗，而心肌細(xì)胞本身儲備的CP是有限的，此時(shí)提供外源性CP參與損傷心肌的能量供應(yīng)，可以解決損傷心肌最根本的能量代謝問題。外源性高能磷酸肌酸鹽已被普遍認(rèn)為在體外循環(huán)手術(shù)中對心肌缺血有良好的保護(hù)作用，主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)病人[6-7]。本研究應(yīng)用外源性磷酸肌酸治療膿毒癥大鼠，證實(shí)其能改善膿毒癥心肌能量代謝障礙和心肌的超微結(jié)構(gòu)。

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