王興紅 李德恒

糖尿病是我國(guó)中老年人常見的疾病，糖尿病腎?。╠ iabetic neph ropathy,DN）是糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是臨床上導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年來(lái)隨著對(duì)自由基氧化損傷的不斷深入研究，證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生的主要病理生理機(jī)制之一[1]。應(yīng)用抗氧化治療，改善氧化應(yīng)激可延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種含有芪類結(jié)構(gòu)非黃酮類多酚化合物，許多基礎(chǔ)研究和臨床觀察均表明，白藜蘆醇具有廣泛的藥理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)試圖觀察白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的近端小管上皮細(xì)胞（p rox im al tubu le epithelial cells,PTEC）氧化應(yīng)激的影響，進(jìn)一步為白藜蘆醇防治DN的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性W istar大鼠，清潔級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水，日常光照。

1.1.2 試劑與儀器 白藜蘆醇，永州一東生物技術(shù)有限責(zé)任公司（＞98％）；優(yōu)級(jí)胎牛血清，北京索萊寶科技有限公司；DM EM培養(yǎng)液，Giboc公司；DAB顯色試劑及SABC（Mouse IgG）試劑盒，武漢博士德公司；一氧化氮檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒和還原型谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀，ELX 800型，美國(guó)。

1.2 原代近端小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 用手工微分離法分離大鼠單根近端小管，原代培養(yǎng)大鼠近端小管上皮細(xì)胞。將近端腎小管置入2m lDM EM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃5％CO2的培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，于第3天更換第1次培養(yǎng)液，7～8d細(xì)胞基本鋪滿瓶底。免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法鑒定細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 用MTT法檢測(cè)高糖和Res對(duì)細(xì)胞增殖的影響，由此選出高糖及藥物濃度。PTEC生長(zhǎng)至基本鋪滿瓶底，將其消化并接種于96孔板，24h后更換為無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化，以后將細(xì)胞分為以下三組：正常對(duì)照組（NC）（DMEM培養(yǎng)基），高糖組（25mmol/L），白藜蘆醇治療組（高糖+Res組），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，作用72h后取樣觀察。

1.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 分別用化學(xué)比色法測(cè)定PTEC的一氧化氮（n itrogen monox idum,NO）、過(guò)氧化氫（hyd rogen perox ide,H2O2）、還原型谷胱甘肽（redu ced g lu tath ione horm one,GSH）水平和過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）活性，均按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。全部資料用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)和方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)PTEC氧化應(yīng)激的影響NO水平 高糖組顯著高于NC組（P＜0.01），高糖+Res組與高糖組比較明顯降低（P＜0.05），與NC組比較無(wú)明顯差異；H2O2水平：高糖組顯著高于NC組（P＜0.01），高糖+Res組較NC組仍明顯升高（P＜0.05），但較高糖組明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 對(duì)PTEC抗氧化能力的影響 CAT活性：高糖組顯著低于NC組（P＜0.05），高糖+Res組較高糖組明顯升高（P＜0.05），與NC組比較無(wú)明顯差異；GSH水平：高糖組明顯低于NC組（P＜0.05），高糖+Res組較高糖組明顯升高（P＜0.05），與NC組比較無(wú)明顯差異。見表2。

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加或清除能力降低，導(dǎo)致活性氧家族（reactive oxygen species,ROS）在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過(guò)程。大量研究均表明，糖尿病存在明顯的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可能是糖尿病血管并發(fā)癥的始動(dòng)因素,高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生大量ROS[3]。目前臨床上對(duì)DN尚無(wú)根治的措施，主要是對(duì)癥治療和改善癥狀為主，療效并不十分滿意。采用中醫(yī)中藥的方法是我國(guó)在DN治療上的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，白藜蘆醇在治療方面的作用尤其引人注目。盡管證實(shí)氧化應(yīng)激在糖尿病血管并發(fā)癥中的主導(dǎo)作用，但抗氧化治療并不樂觀，藥物的選擇、劑量、療程、作用位點(diǎn)等因素都是尚待研究的重點(diǎn)。目前提出的抗氧化病因?qū)W治療有望成為主要的治療方案。

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)PTEC氧化應(yīng)激的影響±s）

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)PTEC氧化應(yīng)激的影響±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，#P＜0.05（下同）

組別 NO H2O2（umol/mg p ro） （umol/mg pro）NC組 0.24±0.11 5.29±2.03高糖組 0.71±0.24** 30.51±14.49**高糖+Res組 0.26±0.09# 12.34±7.68*#

表2 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)PTEC抗氧化能力的影響±s）

表2 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)PTEC抗氧化能力的影響±s）

組別 CAT GSH（umol/mg pro） （umol/mg pro）NC組 9.24±1.06 2.29±0.12高糖組 8.71±1.24* 1.69±0.05*高糖+Res組 9.26±0.49# 2.14±0.28#

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖環(huán)境培養(yǎng)的PTEC NO和H2O2水平明顯增加，白藜蘆醇加入高糖環(huán)境培養(yǎng)的PTEC NO和H2O2水平明顯受到抑制。王翠珍等[4]用CDNA探針與基因表達(dá)譜芯片雜交技術(shù)表明2型糖尿病大鼠腎臟組織某些抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)明顯降低，說(shuō)明腎臟抗氧化防御機(jī)能減退、氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)在DN中起重要作用。NO是內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的一種內(nèi)皮源性舒張因子，參與多種生理和病理過(guò)程，有強(qiáng)烈的舒血管作用，在調(diào)節(jié)腎血流動(dòng)力學(xué)方面起重要作用，也在DN的病因?qū)W上有重要意義。Baines等[5]研究表明3～5周的糖尿病大鼠近端小管不僅一氧化氮合酶蛋白表達(dá)和其活性均升高。正常狀態(tài)下，腎臟有完整的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)。Antonio等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腎臟抗氧化防御機(jī)制的減弱可能在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其中CAT和GSH是兩種重要的抗氧化的物質(zhì)，CAT主要清除高濃度的H2O2。已發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠的大腦和心臟的CAT活性升高，但在肝臟和腎臟卻降低[7]。GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，直接的自由基清除劑，把H2O2還原成H2O，其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽。在用化學(xué)的方法誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物腎臟中GSH濃度降低。本研究也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境培養(yǎng)的PTEC GSH水平與CAT活性均明顯降低，白藜蘆醇治療后可抑制PTEC的GSH水平和CAT活性的降低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示白藜蘆醇甙不僅有抑制氧化應(yīng)激的作用，還有增強(qiáng)抗氧化能力。由此進(jìn)一步表明白藜蘆醇甙具有防治DN的作用，這為抗氧化劑治療DN提供了理論依據(jù)，此作用可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和增強(qiáng)抗氧化的防治功能或別的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其具體相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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[2]張寶紅.白藜蘆醇藥理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2008,8（3）：66-68.

[3]Yorek MA.The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease[J].Ferr Radic Res,2003,37（5）：471-480.

[4]王翠珍,林麗香,陳剛,等.2型糖尿病大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2005,11（2）：3-5.

[5]Baines A,Patrick HO.Glucose stimulate O2 consumpion,NOS,and Na/H exchange in diabetic rat proximal tubules[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2002,283（2）：286-293.

[6]Antonio C,Anna M,Franceschina M,et al.Defective intracellular antioxidant enzyme production in type 1 diabetic patients with nephropathy[J].Diabetes,2000,（49）：2170-2178.

[7]Inoguchi T,Li P,Umeda F,et al.High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C-dependent activation of NADPH oxidase in cultured vascular cells[J]. Diabetes,2000,49（11）：1939-1945.