遲曉麗，邵 璇，周文霞，張永祥

（軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

化療藥誘導的外周神經病變（chemotherapyinduced peripheral neuropathy，CIPN）［1］是多種化療藥物的共同而嚴重的不良反應，如鉑類、紫杉酚類、埃博霉素、長春花屬生物堿類，以及硼替佐米（bortezomib）和來那度胺（lenolidamide）等新上市的化療藥，主要表現(xiàn)為感受神經元異常和神經痛。CIPN目前已成為腫瘤化療中最主要的劑量限制因素之一［1］，嚴重影響了化療藥的療效。如，高居世界抗腫瘤藥物銷售額之首的紫杉醇類藥物在臨床使用中所導致的外周神經病變并不會隨著停藥而得到緩解，而是持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，并且對目前臨床上所使用的任何鎮(zhèn)痛藥物都不敏感，常導致一部分患者被迫減量直至停藥，從而影響化療效果甚至使化療歸于失敗，嚴重影響患者的生存質量［2］。目前尚無有效的 CIPN治療藥物問世。因此，建立CIPN動物模型并在此基礎上研制可以緩解甚至治愈CIPN的藥物是當務之急。近十年來，國內外在建立CIPN動物模型上進行了諸多嘗試，取得了明顯進展，其中最常用的是使用PTX腹腔注射建立成年雄性SD大鼠外周神經病變模型［3］。但是關于影響CIPN模型建立的相關因素卻少有涉及，在此基礎上篩選和評價CIPN藥物的研究更是鳳毛麟角。本研究擬考察影響PTX所致SD大鼠CIPN模型的影響因素，為篩選和研究防治CIPN藥物提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠，雄性，180～220 g，350～400 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供［SCXK（軍）2002-001］。每2只飼養(yǎng)于不銹鋼絲籠中，自由攝食飲水。

1.1.2 藥品及試劑：紫杉醇，購自北京華素制藥股份有限公司，批號0810201。溶劑聚氧乙基蓖麻油/無水乙醇（1∶1）由茹祥斌教授提供。兔抗人PGP9.5多抗，Abcam公司，美國；小鼠抗大鼠MHC class IIRT la（OX-6）單抗，Abcam公司，美國；Cy3標記驢抗兔IgG，BioLegend公司，美國；FITC標記驢抗小鼠IgG，Santa Cruz公司，美國。

1.1.3 動物分組及給藥：動物分為溶劑對照組和給藥組，每組2～9只動物。紫杉醇以1∶1的聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor，CrEL）和無水乙醇做為溶媒，隔日一次腹腔注射給藥，2 mg·kg-1·次共注射4次。

1.2 實驗方法

1.2.1 機械致痛行為學實驗：行為學實驗和給藥由不同的實驗者進行。大鼠放在抬高的鐵絲網上，每只大鼠使用一個透明的有機玻璃盒（30 cm×20 cm ×15 cm）將其罩在下方，限制其活動范圍于此玻璃盒內，任其自由活動5 m in后開始行為學實驗。機械性異常性疼痛、機械性痛覺過敏分別通過4 g和15 g折力的測痛絲進行測試。每只大鼠測試時都遵循折力由小到大的順序進行。測痛絲刺激大鼠后足掌底中部（避開突起部位）5 s，每種折力的測痛絲刺激每只后足5次，每只大鼠共刺激10次。每只大鼠兩只后足對4 g、15 g測痛絲刺激的反應次數(shù)和總刺激次數(shù)的百分比分別作為該只大鼠的機械性異常性疼痛、機械性痛覺過敏的程度。

1.2.2 免疫細胞化學實驗檢測表皮下神經纖維：SD大鼠腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥鈉。先用含有0.05％ 碳酸氫鈉和0.1％亞硝酸鈉的PBS快速灌流1 m in，然后灌流250 m L新鮮配置的PB（0.1 M，含4％多聚甲醛，pH 7.4）30 min。切斷SD大鼠后足，在上述固定液中固定過夜。次日取SD大鼠后足底的一塊遠離跟骨、靠近足底突起的皮膚，在含30％蔗糖的PB溶液中4％冷藏保存過夜。包埋冷凍后低溫恒溫切片（30μm）。在含有10％普通驢血清的PBS+T中室溫孵育1 h。使用含有5％普通驢血清的rabbit anti-human PGP9.5一抗（1∶6400稀釋）4℃孵育24 h。PBS+T清洗后，donkey antirabbit IgG二抗 Cy3標記（1∶200稀釋）孵育1.5 h。mouse anti-rat MHC class II RT la（OX-6）一抗（1∶400稀釋）孵育1.5 h。PBS+T清洗后，donkey antimouse IgG二抗FITC標記（1∶30稀釋）孵育1.5 h。使用熒光顯微鏡10x和20x物鏡，觀察和表皮相連的表皮下神經纖維 （intraepidermal nerve fiber，IENF）的形態(tài)和數(shù)目，IENF沒有最短長度要求，在表皮內分支的IENF計為1根。

1.2.3 電鏡檢測坐骨神經細胞線粒體：大鼠如上述方法固定后取大腿中部約5 mm的坐骨神經，在上述固定液中固定3h。將組織轉移至含有10％蔗糖的0.1M PB中，在4℃放置至少12 h。將組織轉移至含1％四氧化餓的0.1M PB（pH7.4）中，在4℃放置2 h。室溫下，在濃度梯度上升的乙醇和環(huán)氧丙烷中將組織脫水。隨后將組織包埋于環(huán)氧樹脂中。使用鉆石刀頭的超薄切片機制作70 nm切片，F(xiàn)ormvar包裹的網收集超薄切片。將切片進行檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾染色。將切片置于80kV的電鏡下鏡檢，3130x用于觀察大致情況，24400x用于線粒體計數(shù)。

從表2可以看出，處理能增加西瓜坐果率、提高單瓜重、每公頃產量提高4617 kg、處理比對照每公頃產量提高了15.8%，中心糖度提高了2.4度。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS v18.0軟件進行具有一個重復測量的方差分析。

2 結果

2.1 PTX對SD大鼠一般情況的影響

實驗期間未觀察到5組大鼠出現(xiàn)脫毛、腹瀉、運動失常等情況。每2 d或3d測定大鼠體重一次。從圖1（A）和（B）的體重動態(tài)觀測表中可以看出，腹腔注射4次2 mg/kg PTX對SD大鼠的體重增長沒有明顯的影響。

2.2 PTX對SD大鼠機械性異常性疼痛的影響

從圖2（A）、（B）可以看出，經2 mg/kgPTX腹腔注射4次處理后，實驗全程均沒有觀察到初始體重200 g的SD大鼠有明顯的機械性異常性疼痛，但在17 d可以觀察到初始體重400 g的SD大鼠有明顯的機械性異常性疼痛。

2.3 PTX對SD大鼠異常性疼痛過敏的影響

2.4 PTX對SD大鼠后足表皮下神經纖維的影響

對大鼠后足表皮切片進行免疫熒光染色檢測，IENF圖4中粗紅線是表皮，表皮下的亮紅色絲狀物即PGP9.5抗體標記的IENF。從圖4（彩插2）中可以看出，對照組SD大鼠表皮下IENF分布均勻且數(shù)量較多，但卻幾乎觀察不到紫杉醇模型組SD大鼠的表皮下IENF的存在。表明，PTX處理后會導致SD大鼠后足表皮下IENF斷裂，IENF密度顯著降低（圖5）。

2.5 PTX對SD大鼠坐骨神經細胞線粒體的影響

圖6中箭頭表示正常線粒體，帶橫線的箭頭表示空泡變性的異常線粒體。從圖5中可以看出，對照組SD大鼠的坐骨神經感覺神經元軸突中正常線粒體的比例較高，異常線粒體較少，而PTX處理后空泡變性的異常線粒體明顯增多。

圖1 紫杉醇對SD大鼠體重的影響。（A）初始體重200 g SD大鼠；（B）初始體重400 g SD大鼠。Mean±SD，n=2-9。其中對照組2只，模型組9只SD大鼠

3 討論

紫杉醇最先是從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）的樹皮中分離出來的治療實體瘤的最有效和最常用的化療藥物之一。其常見的毒副作用有三種：骨髓抑制、腎毒性和外周神經毒性。骨髓抑制和腎毒性可以通過粒細胞集落刺激因子和大量飲水而分別得到很好的改善。但是，由于缺乏對其治病機制的了解和有效的治療方法，紫杉醇的外周神經毒性仍然是其嚴重的劑量限制因素。紫杉醇可導致患者的感受神經元異常和神經痛等的嚴重的化療藥所致外周神經病變，包括機械性異常性疼痛、機械性痛覺過敏、冷敏異常性疼痛、持續(xù)性灼燒痛、麻刺感和麻木等癥狀，并且這些癥狀不會隨著化療藥的停藥而得到緩解，而是持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年［2］。同時由于CIPN多對目前臨床上所使用的鎮(zhèn)痛藥物不敏感，常導致一部分患者被迫減少化療藥的劑量甚至停藥，從而影響化療效果甚至使化療歸于失敗。迄今為止，CIPN發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全闡明，也沒有可以有效緩解或治療CIPN的藥物問世［4，5］。

圖2 紫杉醇致SD大鼠機械性異常性疼痛的動態(tài)觀測圖。（A）初始體重200 g的SD大鼠組；（B）初始體重400 g的SD大鼠組。Mean±SD，n=2-9，其中對照組2只，模型組9只SD大鼠。＊＊P＜0.01，和對照組相比。

圖3 紫杉醇致SD大鼠機械性痛覺過敏的動態(tài)觀測圖。（A）初始體重200g的SD大鼠組；（B）初始體重400g的SD大鼠組。Mean±SD，n=2-9。其中對照組2只，模型組9只SD大鼠。＊＊P＜0.01*P＜0.05，和對照組比

圖5 紫杉醇對SD大鼠表皮下神經纖維密度的影響。Mean±SD，n=3，＊＊P＜0.01，與對照組比。

圖6 紫杉醇對SD大鼠坐骨神經感覺神經元軸突異常線粒體的影響。電鏡鏡檢SD大鼠坐骨神經感覺神經元軸突線粒體，20000×～40000×。箭頭表示正常線粒體，帶橫線的箭頭表示空泡變性的異常線粒體。（A）對照組；（B）PTX組

有國外學者應用紫杉醇腹腔注射建立SD大鼠外周神經病變模型，但各種模型的建立條件及方法（如給藥劑量、給藥頻率、動物品系、測定方法等）差別很大。值得注意的是，不同品種的實驗動物在篩選CIPN有效藥物時可能有不同的表現(xiàn)，從而得出不同的結論。有少量文獻采用了 W istar大鼠、C57BL/6和 ddY等小鼠作為模型動物［4-8］。本實驗室也曾嘗試使用小鼠作為CIPN的模型動物，但前期工作表明，KM小鼠并不適合用作該病癥的模型動物，因為KM鼠活潑好動，放置在帶鐵絲網的高架臺上30 m in后仍未處于靜息狀態(tài)，若此時強行進行行為學測痛實驗，恐不能正確反映小鼠的痛覺狀態(tài)。而C57BL/6的情況則稍好些，在大約30 m in時就進入靜息狀態(tài)，但仍比SD大鼠耗時（5min）要長。由于使用小鼠建立的 CIPN模型持續(xù)時間短（4～5 d）［7］，和臨床 CIPN癥狀的長時間持續(xù)（～3個月）有相當大的差距，因此小鼠用作CIPN模型動物是否能夠準確反映臨床癥狀還是值得懷疑的。

目前較多采用的是SD大鼠作為CIPN模型動物。Sarah J.L.Flatters等采用大鼠腹腔隔日（0，2，4，6 d）注射2 mg/kg紫杉醇，總計8 mg/kg［9-11］。陳治軍等采用大鼠腹腔隔日（1，3，5，7 d）注射1 mg/ kg紫杉醇，總計 4 mg/kg［12］。據(jù)報道，紫杉醇致外周神經病變屬劑量限制性毒性，沒有量效關系，因此選擇能觀察到明顯病變且未出現(xiàn)明顯全身毒性的劑量為佳。本研究對大鼠采用2 mg/kg隔日注射共4次的方法，觀察到初始體重為400 g的大鼠表現(xiàn)出神經病變，并且其后足IENF斷裂、密度明顯降低表明外周神經病變程度嚴重，而此時大鼠體重并未發(fā)生明顯變化，表明造模劑量合適。

目前研究CIPN的方法包括機械縮足反射（分為特定刺激力度縮足比率、縮足閾值測定兩種方式檢測）、熱敏實驗（熱板反射）和冷敏實驗（丙酮實驗）。陳治軍等使用的是機械縮足反射（縮足閾值測定）和熱敏實驗方法［12］；Shad B.Sm ith等通過考察10種封閉群小鼠的紫杉醇致外周神經病變模型建立可行性，發(fā)現(xiàn)該10種小鼠對熱敏均不敏感，而對機械縮足反射（特定刺激力度縮足比率）及冷敏實驗非常敏感［8］；Sarah J.L.Flatters等同樣單獨采用機械縮足反射（特定刺激力度縮足比率）或連同冷敏實驗進行考察［5，9，10，11］。Elizabeth J.Rahn等采用機械縮足反射法測定縮足閾值［13］。日本學者Takao Hidaka等考察芍藥甘草湯對紫杉醇致外周神經病變的改善效果時采用的是改進過的機械縮足反射方法（特定刺激力度縮足比率）［7］。我們對各種文獻進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，采用機械縮足反射測定特定刺激力度縮足比率的報道最多，該實驗周期較長（約為20～30 d）［5，9，10，11］，更能模擬臨床狀態(tài)，結果更可靠；而采用機械縮足反射測定縮足閾值的報道略少，且實驗周期較短（5～7 d），更適合作為預實驗或CIPN藥物的篩選和初步評價。本研究即選擇了更能模擬臨床狀態(tài)的機械縮足反射測定特定刺激力度縮足比率的方法。

采用機械縮足反射法測定大鼠疼痛常用4-15 g折力的測痛絲。由于正常大鼠受到4 g折力測痛絲的刺激很少發(fā)生縮足反射，而CIPN模型大鼠受到4 g折力的刺激會出現(xiàn)明顯的縮足反射，因此4 g折力對大鼠足底的刺激所引起的反應最能夠代表機械性異常性疼痛。正常大鼠受到15 g折力的測痛絲刺激后有大約5～20％的幾率發(fā)生縮足反射，而CIPN模型大鼠受到15 g折力的刺激出現(xiàn)縮足反射的幾率顯著增加，因此15 g折力的測痛絲對大鼠足底的刺激所引起的反應最能代表機械性痛覺過敏［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在應用同樣劑量的紫杉醇、同樣的給藥方式和給藥頻率的情況下，體重在350～400 g之間的SD大鼠比180～220 g之間的 SD大鼠所表現(xiàn)出來的外周神經病變程度更為嚴重、持續(xù)時間更長，更適合于進行治療藥物篩選和評價。至于初始體重400g左右的SD大鼠對紫杉醇所致外周神經病變更為敏感的原因，我們分析認為，可能是由于初始體重400g的SD大鼠的有效劑量較大，也可能與老年大鼠對化療藥所致外周神經病變更為敏感有關，還有待進一步的研究。

綜上所述，給予初始體重400g的SD大鼠隔日腹腔注射2 mg/kg的PTX共4次的方法成功建立了紫杉醇致外周神經病變動物模型，與臨床 CIPN患者所表現(xiàn)出來的典型癥狀和長時間持續(xù)的特征一致，該模型能夠較為準確地模擬臨床相關癥狀。本研究報道了體重/月齡、造模藥物劑量可能對紫杉醇致SD大鼠外周神經病變模型有重要影響，為篩選緩解紫杉醇和長春新堿所致外周神經病變的藥物建立相對穩(wěn)定、可靠的動物模型，并為探討CIPN發(fā)生的機制奠定了一定基礎。

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