沈陽(yáng)，張書紅，湯亭亭

不同來源成體干細(xì)胞BMP-2基因轉(zhuǎn)染并微囊化后細(xì)胞活性及分泌量觀察

沈陽(yáng)，張書紅，湯亭亭

目的比較不同來源成體干細(xì)胞 BMP-2 基因轉(zhuǎn)染并微囊化后的存活情況，并檢測(cè)分泌至微囊外的 BMP-2 蛋白數(shù)量。

方法從大鼠的骨髓、脂肪和滑膜組織內(nèi)分離培養(yǎng)不同類型的成體干細(xì)胞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、脂肪干細(xì)胞（ADSCs）和滑膜干細(xì)胞（SMSCs）。利用高壓靜電裝置制備海藻酸鈉－聚賴氨酸－海藻酸鈉（APA）微囊，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記細(xì)胞在微囊內(nèi)的存活情況。利用含有 BMP-2 基因的重組腺病毒感染不同來源的成體干細(xì)胞后微囊化包裹，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)分泌到微囊外的 BMP-2 蛋白量。

結(jié)果包裹 4 周后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，BMSCs、ADSCs和 SMSCs 可在微囊內(nèi)長(zhǎng)期存活。ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3 種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在微囊化后都可以持續(xù)分泌 BMP-2 蛋白，其中BMSCs 分泌最多，在第 2、3、4 周和其他 2 種細(xì)胞相比有明顯差異（P＜ 0.01）。

結(jié)論3 種來源的成體干細(xì)胞都可以作為 BMP-2 基因給藥促進(jìn)骨再生研究的候選細(xì)胞，其中以骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為首選。

成體干細(xì)胞； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類； 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

大段骨缺損、骨延遲愈合和不愈合是目前骨科臨床治療的難點(diǎn)。通過移植攜帶生物活性分子基因的細(xì)胞來促進(jìn)組織愈合的組織工程方法為解決這一難題提供了新的治療前景。由于自體細(xì)胞的應(yīng)用存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、不能應(yīng)用于急診患者等缺點(diǎn)，非自體細(xì)胞的移植受到了廣泛重視。在既往的研究中，我們已確立了一種利用海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）微囊包裹基因轉(zhuǎn)染成體干細(xì)胞的方法，證實(shí)微囊可對(duì)非自體細(xì)胞起到免疫隔離作用，目的蛋白也可持續(xù)釋放到微囊外產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[1-2]。

在前述研究中我們應(yīng)用的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，而在目前的組織工程研究中，脂肪來源的干細(xì)胞（ADSCs）和滑膜來源的干細(xì)胞（SMSCs）也得到了廣泛應(yīng)用[3-4]。因此本研究試圖比較骨髓、脂肪、滑膜三種不同來源的干細(xì)胞（BMSCs、ADSCs 和SMSCs）在微囊化包裹后的存活情況，以及 BMP-2基因轉(zhuǎn)染后這些細(xì)胞分泌到微囊外的目的蛋白數(shù)量，以期為骨再生的微囊化基因給藥研究提供一種最適宜的細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) SD 大鼠，雄性，8 周齡，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置。動(dòng)物生產(chǎn)和使用許可證號(hào)碼分別為SCXK（滬）2007-0005 和 SYXK（滬）2007-0007。

1.1.2 試劑和儀器 αMEM 及 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；1% 雙抗（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司。海藻酸鈉（批號(hào) 032K01911，黏度 0.25 Pa.s）和聚賴氨酸（批號(hào) 033K5118）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。BMP-2 ELISA 試劑盒（批號(hào) 271868）購(gòu)自美國(guó) R&D 公司；含有 GFP 標(biāo)記基因的重組腺病毒 Adv-GFP購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；含有 BMP-2 基因的重組腺病毒 Adv-BMP2 由上海生化制品所樓覺人教授提供。

1.2 方法

圖 1 不同來源成體干細(xì)胞的形態(tài)（倒置顯微鏡 × 40）Figure 1 The morphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony forming unit (inverted microscope × 40)

1.2.1 SD 大鼠 BMSCs、ADSCs 和 SMSCs 的分離與培養(yǎng) 采用參考文獻(xiàn)[5]的方法，取大鼠股骨骨髓，稀釋于 10 ml 含 100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素、10% 胎牛血清的 αMEM 培養(yǎng)液中，通過貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng) BMSCs。ADSCs的分離培養(yǎng)根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法，切取大鼠雙側(cè)腹股溝皮下脂肪墊，加入 0.1% I 型膠原酶消化 1 h獲取細(xì)胞，接種于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。SMSCs 的分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[7]的方法，切取大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜加入 0.25% 胰酶消化 5 min，II 型膠原酶消化 3 min 獲取細(xì)胞，接種于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.2 包裹細(xì)胞的微囊制備 在電壓 3 kV、液面距 25 mm、推進(jìn)速度 30 mm/h 的高壓靜電場(chǎng)成囊裝置中，將含有 3 × 106/ml個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液與1.75% 的海藻酸鈉溶液組成的混合液滴入 0.1 mol/L氯化鈣溶液中形成海藻酸鈣微粒，再與 0.05% 聚賴氨酸溶液反應(yīng) 6 min 使微粒外包裹一層聚賴氨酸，加入 0.15% 海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，最后用 55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊。所得微囊置無菌培養(yǎng)皿中，加入 DMEM 培養(yǎng)液 10 ml，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)待用。

1.2.3 Adv-GFP 基因轉(zhuǎn)染和微囊內(nèi)細(xì)胞活力觀察 分別取 3 種細(xì)胞的第 2 代感染 Adv-GFP，每皿細(xì)胞生長(zhǎng)到全皿的 90% 后，加 1 ml Adv-GFP過夜（MOI = 150），再采用 1.2.2 的方法進(jìn)行微囊包裹，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。微囊化 1 ～4 周后分別在熒光顯微鏡下觀察，通過綠色熒光判斷細(xì)胞的存活情況。

1.2.4 BMP-2 基因轉(zhuǎn)染和微囊外基因產(chǎn)物測(cè)定 同樣取 3 種細(xì)胞的第 2 代感染 Adv-BMP2，每皿細(xì)胞生長(zhǎng)到全皿的 90% 后，加 2 ml Adv-BMP2過夜（MOI = 100）。取 3 × 106個(gè)感染細(xì)胞微囊化后置于 15 ml 的培養(yǎng)皿中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。包裹后第 1 ～ 4 周每 2 天收集微囊外的上清液保存，分別匯合收集每周累計(jì)上清液，利用 BMP-2 ELISA 試劑盒并參照說明書的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)。BMP-2 蛋白的分泌量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SAS612 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間細(xì)胞 BMP-2 蛋白的分泌量應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同來源成體干細(xì)胞的形態(tài)

圖 1 顯示，三種細(xì)胞都可以形成集落單位，其中 BMSCs 呈長(zhǎng)梭形，而 ADSCs 和 SMSCs 呈短梭形。

2.2 微囊形態(tài)和干細(xì)胞在微囊內(nèi)的存活情況

圖 2 顯示，我們制作的包裹或不包裹細(xì)胞的微囊的形態(tài)大小基本一致。圖 3 是 GFP 標(biāo)記的BMSCs 在熒光顯微鏡下的照片，包裹干細(xì)胞的微囊大小基本一致，表面光滑，直徑大約在 200 μm左右。包裹后 1 周和 4 周時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，3 種微囊化 GFP 標(biāo)記細(xì)胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光，證實(shí)細(xì)胞仍然存活。ADSCs 和 SMSCs 微囊化后形態(tài)和微囊內(nèi)細(xì)胞的存活與 BMSCs 一致。

2.3 微囊化干細(xì)胞 BMP-2 蛋白分泌量的比較

圖 2 海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態(tài)（倒置顯微鏡 × 100）Figure 2 The morphology of alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules (inverted microscope × 100)

圖 3 GFP 標(biāo)記的 BMSCs 在微囊內(nèi)的存活情況（倒置熒光顯微鏡 × 400），包裹后 1 周（A）和 4 周（B）可見微囊內(nèi)有綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞Figure 3 The viability of GFP labeled BMSCs in the microsapsule at 1 week (A) or 4 weeks(B) after encapsulation indicated by the green fluorence in the micrograph (inverted fluorescence microscope × 400)

圖4 未轉(zhuǎn)染 BMP-2 基因的 3 種成體干細(xì)胞，微囊化后BMP-2 蛋白的基礎(chǔ)分泌量Figure 4 The basic BMP-2 secretion from the microencapsulated cells without BMP-2 gene transfer

圖5 微囊化基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 BMP-2 蛋白分泌（P ＜ 0.01）Figure 5 All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins (P ＜ 0.01)

3 討論

本研究采用的微囊化技術(shù)是將細(xì)胞包封在高分子材料形成的選擇性透過膜中，這種透過膜可使小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、囊內(nèi)活性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物自由出入，防止大分子的免疫球蛋白和免疫細(xì)胞的通過，起到免疫隔離作用。微囊內(nèi)的材料還可延緩生物活性物質(zhì)的釋放，有利于其在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用。1980年，加拿大多倫多大學(xué)的 Lim 和 Sun[8]發(fā)明了海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸（APA）微膠囊，并把豬的胰島細(xì)胞微囊化，移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，結(jié)果表明該人工細(xì)胞成功地調(diào)節(jié)了血糖水平。后來人們又開始將微囊化技術(shù)和基因治療結(jié)合，形成微囊化基因給藥技術(shù)，即利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能，治療相關(guān)疾病，其中大多數(shù)研究集中在神經(jīng)退行性疾病的治療上[9]。

隨著干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，人們開始利用微囊來包裹胚胎干細(xì)胞，研究微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞分化的影響[10]。在前期研究中，我們嘗試用微囊來包裹成體干細(xì)胞[1-2,11]，證實(shí)微囊可對(duì)非自體骨髓來源的 BMSCs 細(xì)胞起到免疫隔離作用，BMP-2 蛋白也可持續(xù)釋放到微囊外產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。本研究則進(jìn)一步證實(shí)，APA 微囊也可用于包裹脂肪來源和滑膜來源的干細(xì)胞 ADSCs 和 SMSCs，并作為BMP-2 基因給藥研究的候選細(xì)胞。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)微囊化細(xì)胞分泌的 BMP-2 蛋白量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，這可能與細(xì)胞在微囊內(nèi)的存活量逐漸減少有關(guān)，也可能與腺病毒的表達(dá)周期有關(guān)。雖然我們制備的微囊能使細(xì)胞在囊內(nèi)長(zhǎng)期存活，但是由于微囊制備材料的生物相容性有待提高、微囊機(jī)械強(qiáng)度的不足、微囊壁滲透性不良以及機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)微囊內(nèi)細(xì)胞的殺傷作用等，體內(nèi)移植仍然面臨微囊內(nèi)細(xì)胞存活時(shí)間短、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化包裹的難題[12]。微囊制備材料的選擇以及微囊制備技術(shù)的改進(jìn)還有很大的空間。

目前已有很多文獻(xiàn)比較肌肉骨骼系統(tǒng)不同來源干細(xì)胞在增殖和多向分化能力方面的差異。Hayashi等[13]比較了大鼠骨髓、骨膜、脂肪來源的干細(xì)胞的成骨潛能，發(fā)現(xiàn)骨髓和骨膜來源細(xì)胞的成骨能力優(yōu)于脂肪來源細(xì)胞，而體內(nèi)異位成骨研究提示骨髓 MSCs 可形成最多的骨組織。Yoshimura等[14]從大鼠骨髓、骨膜、脂肪和肌肉等組織分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨膜和肌肉來源的細(xì)胞成骨能力最強(qiáng)。這些結(jié)果提示不同來源的干細(xì)胞在成骨潛能上有一定的差異。我們的研究結(jié)果提示，BMSCs 在轉(zhuǎn)基因后產(chǎn)生 BMP-2 蛋白的效率最高，由此我們認(rèn)為 BMSCs 可以作為今后微囊化基因給藥平臺(tái)促進(jìn)骨再生研究的首選細(xì)胞。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):96-100

Observation of viability and BMP-2 secretion of three different microcapsulated adult stem cells transfected with BMP-2 gene

SHEN Yang, ZHANG Shu-hong, TANG Ting-ting

ObjectiveTo test the viability and BMP-2 secretion from microcapsulated BMP-2 gene transfected adult stem cells derived from different tissue.

MethodsThe bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), adipose-derived stem cells (ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells (SMSCs) from rat tissue were isolated and encapsulated by the alginate-poly-L-lysine-alginate (APA)microcapsules produced by high voltage electrostatic generator.The viability of GFP labeled cells in APA microcapsules were observed by fluorescence microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.Then the BMSCs, ADSCs and SMSCs were infected by the adenovirus containing BMP-2 gene and encapsulated in APA microcapsules.The ELISA method was used to determine the BMP-2 secretion in supernatant of cultured microcapsules.

ResultsThe viability of encapsulated GFP labeled stem cell could be demonstrated by the microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins.BMSCs could secret most BMP-2 proteins which was significant higher than ADSCs or SMSCs at 2, 3 and 4 weeks (P＜ 0.01) after BMP-2 gene transfection and cells encapsulation.

Conclusion All three kinds of adult stem cells could be used to promote the bone regeneration by the strategy of microcapsule based BMP-2 gene medicine, among which BMSCs is the first choice.

Adult stem cells; Bone morphogenetic proteins; Gene transfer techniques

TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmai.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(2):96-100

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（30772183）；上海教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)基金（J50206）

200011 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科/上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

湯亭亭，Email：tingtingtang@hotmail.com

2011-01-18

Author Affiliations: Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedic Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200011, China

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