高旭，周正，沈恩允，景曉娟，郭雷鳴，王仙斌，孫勁文，杜云峰

·論著·

抗DR5單抗CTB006聯(lián)合5-FU對結直腸癌細胞系作用研究

高旭，周正，沈恩允，景曉娟，郭雷鳴，王仙斌，孫勁文，杜云峰

目的探討腫瘤壞死因子相關誘導配體受體（DR5）激動型單抗 CTB006 對人結直腸癌細胞系 SW1116、SW480、SW620、Colo205 的影響。

結直腸腫瘤； 受體，TNF 相關凋亡誘導配體； 藥物協(xié)同作用； 氟尿嘧啶

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術，2011，6(2):106-110

結直腸癌發(fā)病率和病死率在國內外有逐年上升的趨勢，其中我國死亡率達到 7.42/10萬[1]。盡管外科技術不斷提高，但根治術后 5 年生存率仍徘徊在 50％ 左右，故多數學者主張綜合治療[2]。在生物治療領域，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體受體 TRAIL-R1（death receptor4，DR4）及TRAIL-R2（death receptor5，DR5）具有介導細胞凋亡的特性，TRAIL受體激動劑（包括 TRAIL 和激動型抗體）成為國際上研究新方向。本實驗室利用人源化抗人 DR5 激動型單克隆抗體 CTB006，結合臨床結直腸癌 Duke’s 臨床分期，分別選用SW1116（Duke’s A 期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和 Colo205（Duke’s D 期）結直腸癌細胞，研究 CTB006 對之誘導凋亡作用，同時觀察治療效果和受體表達有無相關性，并與化療藥物 5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用，觀察有無協(xié)同殺傷作用，為 CTB006 的臨床腫瘤治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

抗人 DR5 單克隆抗體 CTB006 由北京同為時代生物技術有限公司提供；不同分期結直腸癌細胞 SW1116、SW480、SW620、Colo205 和人胚肺成纖維細胞（HELF）購自美國模式菌種收藏中心（ATCC）；細胞培養(yǎng)材料、胎牛血清（FBS）購自美國 GIBCO 公司；ATPlite 檢測試劑盒購自美國PerkinElmer 公司（批號：0RD00694）；羊抗人IgG-RPE（批號：1031-09）、羊抗人 RPE（批號：A0808-PB59）為美國 Southern Biotech 公司產品；5-FU 為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產品（批號：090807）。BHP9504-2 型微孔板發(fā)光分析儀為北京濱松光子技術有限公司產品；Cytomics? FC500 型流式細胞儀為美國 Beckman Coulter 公司生產。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將 SW1116、SW480、SW620 和HELF 細胞培養(yǎng)于含 10％ FBS、0.1％ 青霉素 + 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液；Colo205 細胞培養(yǎng)于含 10 mmol/L HEPES緩沖液、1 mmol/L 丙酮酸鈉、10％ FBS、0.1％ 青霉素 + 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液。在 37 ℃，含 5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 ～ 5 d，用 0.25％ 胰酶消化，以 1∶1 ～ 1∶3傳代，收集對數生長期、生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.2.2ATPlite 法檢測抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 合用對結直腸癌細胞系增殖的影響

1.2.2.1實驗分組及劑量 把 SW1116、SW480、SW620、Colo205 分別設 CTB006 組、CTB006 + 5-FU 合用組和 5-FU 組。CTB006 組給予劑量分別為 1.88、0.94、0.47、0.24、0.12 nmol/L，1 h 后 CTB006 組和聯(lián)合用藥組加羊抗人 RPE 二抗；5-FU 組劑量分別為 1600、800、400、200、100 μmol/L；CTB006 + 5-FU 合用組依照上述兩藥濃度梯度共同給藥。另設 CTB006 和 5-FU 單用組用于評價CTB006對 HELF 細胞的靶向治療作用。各組均設陰性對照[3]。

1.2.2.2ATPlite 法檢測細胞存活率[4]用 0.25％胰蛋白酶消化細胞，用含相應 DMEM 或 RPMI1640培養(yǎng)液配成 6 × 104個/L 單個細胞懸液，按每孔50 μl 接種于 96 孔板，CO2孵箱（37 ℃，5％ CO2）內培養(yǎng) 24 h 后加上述各組藥物，每組 3 個復孔，每孔終體積為 100 μl。48 h 后依照 ATPlite 試劑盒說明每孔加入 50 μl 細胞裂解液，震蕩 3 min。吸取裂解上清 50 μl 于酶標板中，再加入 25 μl 發(fā)光液，震蕩 10 s 后，避光靜置 3 min。將孵育好的酶標板放入發(fā)光儀，讀取發(fā)光值。使用 BHP9504微孔板發(fā)光分析儀 4.3.32 軟件進行數據處理。細胞存活率（survival rate）=（樣品發(fā)光值平均值/對照組發(fā)光值平均值）× 100％。實驗重復 3 次，取平均值。

評價聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的抑制是否有協(xié)同作用，采用兩種藥物聯(lián)合作用系數（combination index，CI），CI = AB/(A × B)，根據活細胞數（發(fā)光度值）進行計算。AB 是兩藥聯(lián)合組與對照組的比值；A 和 B 是各藥單獨使用組與對照組的比值。如 CI ＜ 1，證明兩藥作用性質為協(xié)同；如 CI = 1，則兩藥無相互作用；如 CI ＞ 1，則兩藥作用性質為拮抗[5]。

1.2.3流式細胞儀技術檢測結直腸癌細胞系表面DR5 表達 將消化好的結直腸癌細胞，用含 2％ FBS 的 PBS 洗液 524 ×g離心 4 min。細胞盡量要求為單個。計數后將細胞稀釋為 2 × 106個/ml，加入 96 孔圓底板中，每孔 50 μl。將 CTB006 稀釋為 15 nmol/L，取 50 μl 與細胞混合，使終濃度為 7.5 nmol/L。冰上孵育 1 h。洗液洗 2 次，524 ×g離心，每次 4 min。羊抗人 IgG-RPE 1∶250 稀釋，取 20 μl 加入各孔中，混勻細胞。同時設只加二抗的陰性對照。冰上孵育 15 min。洗液 524 ×g洗 2 次，每次 4 min。每管加入 300 μl 洗液，4 ℃ 下放置，30 min 內上機檢測。用 WinMID 2.9 軟件分析結果，求出各株細胞表面DR5與抗體結合率Gated％。實驗重復 3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 抗人 DR5 單抗 CTB006 的靶向治療作用

四株結直腸癌細胞及 HELF 均生長狀態(tài)良好。SW1116、SW480、SW620 為貼壁生長，Colo205為半懸浮生長。5-FU 對 HELF 細胞增殖抑制明顯，且呈劑量依賴，濃度為 100 μmol/L 時細胞生存率為（89 ± 1）％，400 μmol/L 時細胞生存率為（60 ± 1.3）％，1600 μmol/L 時細胞生存率為（40 ± 2）％，；CTB006 對 HELF 細胞隨濃度變化細胞生存率維持在（98 ± 5）％，無增殖抑制作用。

2.2 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 對結直腸癌細胞抑制增殖的影響

不同濃度 CTB006、5-FU 以及聯(lián)合用藥組對結直腸癌 4 株細胞系存活率的影響見圖 1。CTB006 對早期結直腸癌細胞 SW1116 抑制增殖效果欠佳；對中晚期結直腸癌細胞 SW480、SW620 和 Colo205 有著良好的抑制增殖作用。對單一細胞取藥物濃度為 CTB006 0.47 nmol/L 和 5-FU 400 μmol/L 時的細胞存活率，采用完全隨機設計的方差分析對結果進行分析，分析其不同作用方式差異。SW1116（F= 12.38，F0.01(2，6)= 10.92，12.38 ＞F0.01(2，6)，P＜ 0.01）；SW480（F= 7.92，F0.05(2，6)= 5.14，7.92 ＞F0.05(2，6)，P＜ 0.05）；SW620（F= 54.46，F0.01(2，6)= 10.92，54.46 ＞F0.01(2，6)，P＜ 0.01）；Colo205 （F= 57.92，F0.01(2，6)= 10.92，57.92 ＞F0.01(2，6)，P＜0.01）。認為 CTB006、5-FU 和聯(lián)合用藥三種不同給藥方式作用后，總體存活率均數不全相等，存在統(tǒng)計學差異，即不同給藥方式的抑瘤效果有差別（P＜ 0.05）。采用隨機區(qū)組設計分析 CTB006 不同濃度對四株結直腸細胞存活率差異（F= 20.21，F0.01(3，12)= 5.95，20.21 ＞F0.01(3，12)，P＜ 0.01），認為相同濃度的 CTB006 對 4 種不同細胞的抑瘤效果有差別（P＜ 0.01）。當 CTB006 聯(lián)合使用 5-FU后，對中晚期細胞 SW480、SW620 和 Colo205 殺傷效果明顯提升，并呈劑量依賴關系，CI ＜ 1 表現為協(xié)同作用（表 1）。對于早期結直腸細胞 SW1116，CI ≥ 1，兩藥作用表現為拮抗或相加。

圖1 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 合用對結直腸癌細胞系增殖的影響（±s，n = 3）Figure 1 The inhibitory effect of anti-human DR5 monoclonal antibody CBT006 combined with 5-FU on the proliferation of colorectal cancer cell lines (±s，n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數（CI）（±s，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s ，n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數（CI）（±s，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s ，n = 3)

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圖2 結直腸癌細胞膜表面 DR5 表達水平Gated％（±s，n = 3）（空心黑色圖形為陰性對照組 DR5 結合率，紅色圖形為該細胞表面 DR5 表達情況）Figure 2 The expression of colorectal cancer cell surface DR5 levels (±s，n = 3) (The hollow black graphics for DR5 binding negative control group，the red graphic expression of the cell surface DR5)

2.3 不同結直腸癌細胞表面 DR5 表達水平差異

不同分期結直腸癌腫瘤細胞表面 DR5 的表達水平有較大的差異。早期 SW1116 細胞 DR5 的表達水平較低，早中期 SW480 細胞呈中水平表達DR5，中晚期 SW620、Colo205 細胞呈中高水平表達 DR5（圖 2）。采用 Gated％ 指標利用區(qū)組方差分析統(tǒng)計，不同結直腸癌細胞表面的 DR5 表達水平有統(tǒng)計學差異（F = 5.17，F0.05(3，12)= 3.49，5.17 ＞ F0.05(3，12)，P ＜ 0.05）。

3 討論

3.1 抗 DR5 單克隆抗體的藥理作用

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥是導致治療失敗的主要原因，且長期使用化療藥物存在大量毒副作用。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）能誘導多種腫瘤細胞和轉化細胞發(fā)生凋亡，降低毒副反應，而 TRAIL 是通過其受體 DR4 （TRAIL-R1）及 DR5（TRAIL-R2）結合介導腫瘤細胞凋亡的[6]。DR4、DR5 屬于 TNFR（TNF receptor）基因超家族，均為 I 型跨膜蛋白，兩者有 55％ 同源。兩者在細胞外區(qū)域都含有兩段富含半胱氨酸的結構域（cysteine-rich domains，CRDs），細胞內區(qū)域有與TNFR、Fas 等同源的一段 70 個氨基酸的死亡結構域（death domain，DD）。由于都含有 DD，DR4 和 DR5 在與 TRAIL 結合后都可傳導死亡信號而誘導細胞凋亡，所以被稱作死亡受體，它們可在人體多種組織中表達[7]。

但一些研究發(fā)現，TRAIL 對正常肝細胞有毒性作用，限制了其臨床應用[8]。Ichikawa等[9]實驗表明抗 DR4、DR5 單克隆抗體能模擬 TRAIL 誘導腫瘤細胞凋亡，且對人正常肝細胞沒有毒副作用。雖然 DR4 和 DR5 在 4 ℃ 與 TRAIL 具有相似的結合力，但在 37 ℃ DR5 與 TRAIL 的親和力最強[10]。LaVallee 等[11]研究表明，TRAIL 與臨床常用化療藥物對腫瘤細胞具有協(xié)同殺傷作用，提示TRAIL 死亡受體（DR4、DR5）的功能性單抗亦可能增強化療藥物殺傷腫瘤細胞作用。上述結果說明，DR5 在 TRAIL 誘導細胞凋亡方面十分重要。

3.2 抗 DR5 單克隆抗體的臨床應用

近年來國內外報道文獻多為鼠源性單抗[12–13]，在臨床治療中主要存在的問題是產生人抗鼠抗體（HAMA）反應，而且尚未見針對其進行臨床分期系統(tǒng)性研究，亦未見到應用人源化抗體協(xié)同 5-FU增效作用的報告。本實驗采用的人源性抗人 DR5特異性單克隆抗體 CTB006，HAMA 反應率較鼠源性單抗低，且從美國 ATCC 引進了針對結直腸癌臨床 Duke’s 分期的細胞系 SW1116（Duke’s A期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和Colo205（Duke’s D 期），結合 5-FU 進行協(xié)同作用研究。

本研究表明：相對于 5-FU，人源 DR5 單抗CTB006 并未見對正常細胞株 HELF 有抑制作用，符合目前低毒、高效的分子靶向藥物治療趨勢。CTB006 對早期 SW1116 抑制增殖效果欠佳，聯(lián)合應用 5-FU 主要表現為拮抗作用。我們認為可能是因為早期結直腸癌組織癌變只侵犯黏膜層，惡變程度低，細胞表面 DR5 表達量亦低，從而導致抗體效應較差。這也與目前臨床應用指南中對于Duke’s A 期患者不推薦使用輔助性化療不謀而合。CTB006 對中晚期結直腸癌細胞 SW480、SW620 和Colo205 有著良好的增殖抑制作用，抑制率可達到 40％ ～ 90％，CTB006 聯(lián)合應用 5-FU，存在顯著的協(xié)同增效趨勢，達到相同療效時可以顯著減少兩者的用量，減少毒副作用的同時保證療效。

結合流式細胞儀檢測細胞 DR5 表達量分析可得出細胞抑制率和細胞膜表面 DR5 表達量呈正相關。我們認為隨病程進展，結直腸癌細胞表面 DR5表達逐步升高，引發(fā)該效應靶點反應增加，從而使藥效增強。雖然國際上普遍認為死亡受體膜表達與細胞殺傷存在聯(lián)系可能性不大，但在目前尚未尋找到更好的高效指示劑的條件下檢測膜表面受體表達量不失為一個彌補辦法[14]。據報道多種化療藥物可上調 DR5 表達增強治療效果[15]，從另一方面提供了其作為指示劑的佐證。

由于我們選用細胞的局限性，目前我們針對Duke’s 臨床分期結果觀察到的研究結果還需擴展細胞系種類來驗證。另外，還有待于進一步從分子機制深化實驗研究，從而為今后動物實驗和臨床工作提供依據。

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Effects of the combination of anti-human DR5 monoclonal antibody and 5-Fluorouracil on the proliferation of colorectal cancer cells in vitro

GAO Xu，ZHOU Zheng，SHEN En-yun，JING Xiao-juan，GUO Lei-ming，WANG Xian-bin，SUN Jin-wen，DU Yun-feng

ObjectiveTo approach the effects of the combination of tumor necrosis factor-related inducing ligand receptor (DR5) monoclonal antibody CBT006 and 5-Fluorouracil (5-FU) on the proliferation of human colorectal cancer cells.MethodsATPlite assay was used to detect the influences of CBT006 and 5-FU alone or in combination on the proliferation of human colorectal cancer cells including SW1116，SW480，SW620 and Colo205 in different pathological stages. The expression of cell surface DR5 levels were examined by using flow cytometry. In the end，we investigated the relationship between the influences and the expression level of DR5.ResultsCTB006 and 5-FU decreased the survival of the colorectal cancer SW1116，SW480，SW620 and Colo205 cells. There exited bad effect on the proliferation of SW1116 at an early pathological stage by CTB006，but it showed a good inhibitory effect of the growth of advanced colorectal cancer SW480，SW620 and Colo205 cells. There was a synergistic effect of the combination of CBT006 and 5-FU on the survial of advanced colorectal cancer cells. By flow cytometry，DR5 expression levels were (47.01 ± 30.4)％，(76.11 ± 15.1)％，(86.77 ± 9.3)％，(93.55 ± 7.9)％ in SW1116 cells，SW480 cells，SW620 cells and Colo205，respectively.ConclusionsCBT006 showed strong inhibitory effect on the proliferation of advanced colorectal caner cells and exerted synergistic effects on these cancer cells when combined with 5-FU.

Colorectal neoplasms; Receptor，TNF-related apoptosis-inducing ligand; Drug synergism; Fluorouracil

s:ZHOU Zheng，Email: zhzh0386_cn@sina.com; SHEN En-yun，Email: eyshen@cotimesbiotech.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.005

063000 唐山，華北煤炭醫(yī)學院研究生部（高旭、王仙斌）；100028 北京，煤炭總醫(yī)院普外腫瘤科（周正、孫勁文、杜云峰）；100176北京同為時代生物技術有限公司（沈恩允、郭雷鳴）；100091 北京，中國人民解放軍總參謀部總醫(yī)院內分泌科（景曉娟）

周正，Email：zhzh0386_cn@sina.com；沈恩允，Email：eyshen@cotimesbiotech.com

2010-12-09

方法采用 ATPlite 法檢測 CTB006 組、5-FU 組及兩藥物合用組作用后的細胞存活率，流式細胞儀技術檢測細胞系表面 DR5 的表達水平，研究兩者之間的關系。

結果CTB006 和 5-FU 對四種結直腸癌細胞增殖均表現出抑制作用。CTB006 對早期細胞 SW1116 增殖抑制效果欠佳，對中晚期細胞 SW480、SW620、Colo205 有著良好的增殖抑制作用（P ＜ 0.05）。當聯(lián)合使用 5-FU 后，對后三者有明顯的協(xié)同作用。流式細胞儀檢測 DR5 表達水平，SW1116 細胞表達（47.01 ± 30.4）％，SW480 細胞表達（76.11 ± 15.1）％，SW620 細胞表達（86.77 ± 9.3）％，Colo205 細胞表達（93.55 ± 7.9）％。

結論 CTB006 對中晚期結直腸癌殺傷作用較強，聯(lián)用5-FU 具有顯著的協(xié)同作用。

Author Affiliations:Graduate Department of North China Coal Medical University，Tangshan 063000，China (GAO Xu，WANG Xian-bin); Oncology and General Surgery Department，Coal General Hospital，Beijing 100028，China (ZHOU Zheng，SUN Jin-wen，DU Yun-feng); Beijing Cotimes Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 100176，China (SHEN En-yun，GUO Lei-ming); Endocrinology Department of General Hospital of PLA General Staff Headquarters，Beijing 100091，China (JING Xiao-juan)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2011，6(2):106-110