戴 冰， 肖子曾， 冷 旺， 梅 君

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208)

在真核生物中，外部信號(hào)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核影響基因的轉(zhuǎn)錄變化涉及許多信號(hào)通路，環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號(hào)途徑是其中的范例之一。有研究表明，六味地黃湯能改善和調(diào)節(jié)陰虛型小鼠血漿cAMP系統(tǒng)［1］，而目前研究六味地黃方對(duì)cAMP的作用主要停留在血液中cAMP的階段，為了進(jìn)一步闡明該方對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的作用，我們選用了大鼠前脂肪細(xì)胞作為研究對(duì)象，來探討六味地黃丸的藥理作用與cAMP的關(guān)系;同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素可明顯升高RPE細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，其作用機(jī)制是通過結(jié)合RPE細(xì)胞膜上β-AR，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加［2］。因此我們選用腎上腺素作用大鼠前脂肪細(xì)胞，旨在探討六味地黃丸對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與藥物 健康SD大鼠，清潔級(jí)，♀♂各半，體重(200±20)g，由長沙市開福區(qū)東來創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)中心提供，許可證號(hào):SCXK(湘)2006-0001。六味地黃丸(濃縮丸)，由湖南省長沙九芝堂制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為060361。

1.2 試劑與儀器 腎上腺素(批號(hào):20060514)，pH7.2緩沖生理鹽水(自制)，含酚紅 DMEM低糖培養(yǎng)基(批號(hào)123K83031)購自 Sigma公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(批號(hào)20050617)購自蘭州民海生物有限公司，胰酶購自sigma公司，cAMP試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)同位素室，其余試劑均為分析純;3K30型高速冷凍離心機(jī)(sigma公司產(chǎn)品)，UV-1600紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品)，佳能照相系統(tǒng)，XDS-1B體式倒置相差顯微鏡(日本Olympus)，Heracell型細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國賀利氏產(chǎn)品)，超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，恒溫水浴箱(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 六味地黃丸藥液的制備 取六味地黃丸120丸加純凈水約300 mL，攪拌，超聲使之完全溶解后，添加純凈水至375 mL，使其藥液濃縮至2.0 g/mL，供實(shí)驗(yàn)用。

2.2 含藥血清的制備 取SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，♀♂各半，禁食不禁水12 h，第1組以六味地黃丸30 g/kg的劑量灌胃給藥，每天3次，連續(xù)3 d，于第3天最后一次給藥后1 h，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)肝門靜脈取血5 mL，第2組作為空白對(duì)照組灌以等量的水，操作同上，所有兩個(gè)組取血后靜置4 h，1 500 r/min離心30 min，取上清液，分裝，-20℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)前將第1組含藥血清以增殖培養(yǎng)液配成終濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)液，即低、中、高不同劑量組。(終濃度=加入的血清體積/總體積×100%)。

2.3 大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng) 取雄性大鼠腹股溝部純凈脂肪顆粒，pH 7.2緩沖生理鹽水(PBS)洗滌后剪成0.5～1 mm3大小均勻的小顆粒，以1 000 r/min離心10 min取上層的純脂肪顆粒，輕輕地鋪于經(jīng)培養(yǎng)液潤濕的培養(yǎng)瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培養(yǎng)液5～10 mL，塞緊瓶塞，將底面翻轉(zhuǎn)朝上。37℃、5%CO2培養(yǎng)1～2 h，待黏附牢固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶做正常培養(yǎng)每日觀察。原代培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達(dá)到約1/2瓶底面積后即可傳代，取培養(yǎng)7代以內(nèi)的大鼠前脂肪細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 分組、給藥 取傳代7代以內(nèi)的細(xì)胞分為空白大鼠血清組(簡稱空白組)、腎上腺素+空白大鼠血清組(簡稱腎上腺素組)、六味地黃丸含藥血清高劑量組(簡稱丸高組)、六味地黃丸含藥血清中劑量組(簡稱丸中組)，六味地黃丸含藥血清低劑量組(簡稱丸低組)、六味地黃丸含藥血清+腎上腺素組(簡稱含腎藥物組)，空白組和六味地黃丸高、中、低組分別加入2.2項(xiàng)所制備的相對(duì)應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)液，含腎空白組以及含腎藥物組先分別加入10 nmol/L的腎上腺素血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換2.2項(xiàng)所制備的相對(duì)應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)液。六味地黃丸含藥血清于細(xì)胞傳代后立即給予，待培養(yǎng)區(qū)域性單層匯合達(dá)到約1/2瓶底面積后加入腎上腺素。

2.5 細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的檢測 取第六代大鼠前脂肪細(xì)胞以2×105個(gè)/mL的濃度傳于50 mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)至生長旺盛時(shí)，棄培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用pH4.75的醋酸緩沖液懸浮，調(diào)整濃度至106個(gè)/mL，取1 mL細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，使細(xì)胞沉淀，棄去上清液，細(xì)胞沉淀加1 mL pH4.75的醋酸緩沖液混懸，反復(fù)凍融3～4次，3 000 r/min離心15 min。取上清液100 μL按所購“cAMP測定放射免疫分析試劑盒”使用說明書進(jìn)行測定。利用cAMP與125I-cAMP和特異性蛋白激酶競爭結(jié)合原理測定細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，GC-1200 r放射免疫計(jì)數(shù)器上測定放射性強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出細(xì)胞內(nèi)cAMP含量。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 結(jié)果

六味地黃丸對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響，結(jié)果見表1

表1 對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響

表1所示:腎上腺素組與空白組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，提示腎上腺素能明顯使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP含量升高;丸劑各劑量組與空白組比較，六味地黃丸中劑量組和高劑量組有顯著性差異，提示丸劑中劑量和高劑量含藥血清均能使大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低，低劑量對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平?jīng)]有影響;含腎藥物組與腎上腺素組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，提示六味地黃丸能降低腎上腺素使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高的作用。同時(shí)，含腎藥物組與空白組比較，沒有顯著性差異，進(jìn)一步說明在腎上腺素使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高后，六味地黃丸含藥血清能使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量恢復(fù)到正常水平。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸含藥血清各濃度對(duì)大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平均有降低的作用;六味地黃丸能拮抗腎上腺素升高大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平的作用，并使其cAMP含量恢復(fù)到正常水平。由于腎上腺素對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的作用是通過激動(dòng)細(xì)胞膜表面β受體途徑達(dá)到的，因此，六味地黃丸對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的影響也可能是由于阻斷細(xì)胞膜表面β受體途徑而產(chǎn)生的。

4 討論

原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)(primary fat cell culture)是指用膠原酶消化，將得到的脂肪細(xì)胞作體外培養(yǎng)［3］。目前國內(nèi)外前脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)大致有兩類，一類來源于血管基質(zhì)組份細(xì)胞(stromal vascular fraction，SVF)，這是經(jīng)典的前脂肪細(xì)胞。此外，近年還有人報(bào)道采用脂肪組織塊貼壁和天花板培養(yǎng)相結(jié)合的方法并獲得了成功［4］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用脂肪組織塊貼壁和天花板培養(yǎng)相結(jié)合的方法對(duì)大鼠皮下脂肪的前脂肪細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出了大鼠前脂肪細(xì)胞，并且生長良好。

離體培養(yǎng)細(xì)胞是從細(xì)胞水平研究藥物機(jī)制較為理想的體外模型。同時(shí)由于中藥多屬粗制劑，如果直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，其中的雜質(zhì)、電解質(zhì)及酸堿度等都會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法可在某種程度上克服上述干擾，不僅反映藥物可吸收部分的直接作用，通過對(duì)照，也可反映藥物在機(jī)體作用下形成的代謝物誘生的機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的影響，且更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程。

cAMP是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì)，由三磷酸腺苷(ATP)在腺苷環(huán)化酶(AC)催化下生成。細(xì)胞內(nèi) cAMP增多，能激活 cAMP依賴性蛋白激酶 A(APK)，使細(xì)胞內(nèi)許多蛋白酶磷酸化而使之活化，從而調(diào)節(jié)代謝，產(chǎn)生生理效應(yīng)［5］。不少實(shí)驗(yàn)資料也表明，當(dāng)cAMP發(fā)生含量變化時(shí)，細(xì)胞的功能也隨之發(fā)生明顯變化［6］。隨著細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)研究的深入，通過調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)來研究六味地黃方已倍受關(guān)注。

六味地黃方乃滋陰補(bǔ)腎之名方，同時(shí)該方還具有抗癌、增強(qiáng)細(xì)胞免疫性、調(diào)節(jié)血壓、血脂等方面的作用［7-8］。近年來對(duì)該方的研究比較多，也研究的比較深刻，目前研究六味地黃方對(duì)cAMP信使的報(bào)道不多，而且大部分基于陰虛血液中cAMP含量的研究，有人報(bào)道［4］了對(duì)氫考I型法復(fù)制腎陰虛小鼠服用六味地黃沖劑，顯示小鼠血漿中的cAMP含量較未服藥腎陰虛組小鼠明顯降低。目前研究該方對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的報(bào)道甚少，而cAMP信使系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的信息傳導(dǎo)通路，具有多種生理及病理作用，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化，維持平滑肌舒縮平衡和血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，參與神經(jīng)活動(dòng)，調(diào)控基因表達(dá)等方面居重要地位［9］。隨著研究的深入，其在臨床治療學(xué)中的意義也日益凸顯。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能明顯降低大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，而六味地黃方自古被認(rèn)為是滋陰的良方，所以研究六味地黃丸滋陰作用是否是通過改變細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量而達(dá)到的，甚至該方的其他藥理作用是否與細(xì)胞內(nèi)cAMP水平及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)，對(duì)我們進(jìn)一步加深對(duì)該方藥理作用本質(zhì)的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生積極作用。

腎上腺素是腎上腺髓質(zhì)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，它是α、β受體激動(dòng)藥，它能通過激動(dòng)β受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有降低大鼠前脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)腎上腺素與六味地黃丸聯(lián)合使用時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平與正常時(shí)相比較沒有顯著差異，表明六味地黃丸能拮抗腎上腺素降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的作用，而腎上腺素本身能通過激動(dòng)β受體使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，六味地黃丸對(duì)腎上腺素的拮抗作用究竟是否完全是通過阻斷細(xì)胞膜上β受體來達(dá)到的，仍需更深入的研究。

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