王海華

(廣西南寧食品藥品檢驗所，廣西南寧530001)

復(fù)方丹參片收載在《中國藥典》2005年版一部［1］，含丹參、三七、冰片3種中藥成分，具有活血化瘀，理氣止痛的功效。處方中丹參和冰片兩味中藥材，均對某些細菌的生長繁殖有一定抑制作用［2-6］。為保證臨床用藥的安全性，目前各國藥典對口服制劑的微生物污染狀況有明確的質(zhì)控指標［1，7-10］。在藥品監(jiān)督檢驗工作中，經(jīng)常遇到該品種不同生產(chǎn)廠家提供的微生物限度檢查資料所采用的方法差異很大，本實驗通過回收率實驗對16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片的抑菌作用強弱進行了比較，為該品種的微生物限度檢驗方法的建立提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SPS202F電子天平［奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司］;TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);LRH-250-A型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);HR-8753GM微波爐(青島海爾微波制品有限公司);Ⅱ級生物安全柜(上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)等。

1.2 實驗菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］，由中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)，改良馬丁培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.4 樣品 復(fù)方丹參片，16個廠家生產(chǎn)(編號分別為 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P)，從市場購買。

2 方法［1］

2.1 菌液的制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備 取樣品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，制備成溶解均勻的1∶10的供試液。

2.3 采用方法

2.3.1 常規(guī)法 取1∶10的供試液1 mL注皿。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10的供試液1mL注入2個平皿(0.5 mL/皿)或5個平皿(0.2 mL/皿)。

2.3.3 低速離心法加培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10供試液10 mL至無菌離心管中，500 r/min離心5 min，取上清液1 mL分別注入2個平皿(0.5 mL/皿)或5個平皿(0.2 mL/皿)。

2.3.4 低速離心法加薄膜過濾法 取1∶10供試液10 mL至無菌離心管中，500 r/min離心5 min，取上清液1 mL 薄膜過濾，沖洗 100、200、300、400、500 mL。

3 回收率測定

3.1 試驗組 按2.3項下方法操作后，分別加入試驗菌50～100 cfu注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度，細菌培養(yǎng)24～48 h，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h，測定其菌數(shù)(薄膜過濾法取上述供試液過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌50～100 cfu，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù))。

3.2 菌液組 取試驗菌50～100 cfu注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其余操作同3.1項。

3.3 供試品對照組 按2.3項下方法操作后，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其余操作同3.1項。

3.4 稀釋劑對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-白胨緩沖液1mL和試驗菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中?？疾煜♂寗υ囼炗袩o干擾。該對照組各試驗菌的回收菌應(yīng)不低于70%。

試驗組的加菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/(菌液組的平均菌落數(shù))×100%。

稀釋劑對照組的加菌回收率(%)=(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù))/(菌液組的平均菌落數(shù))×100%。

4 結(jié)果

4.1 預(yù)試驗結(jié)果 按照藥典規(guī)定的5種試驗菌，采用常規(guī)法測定16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片的回收率，以確定敏感菌株。預(yù)試驗結(jié)果見表1。

表1所見，16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片，金黃色葡萄球菌采用常規(guī)法回收率幾乎全部為0，表明復(fù)方丹參片對細菌抑制作用明顯，確定細菌數(shù)測定選用金黃色葡萄球菌作為敏感菌株進行預(yù)試驗。黑曲霉的回收率均大于70%，而白色念珠菌有6個廠家的回收率小于70%，故確定霉菌、酵母菌數(shù)測定選用白色念珠菌作為敏感菌株進行預(yù)試驗。

4.2 細菌數(shù)測定方法的確定 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選用金黃色葡萄球菌作為敏感菌株進行試驗，以確定細菌數(shù)測定方法。按2.3項下操作，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果得出:要達到藥典規(guī)定回收率大于70%的要求，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片需采用不同的方法:

編號E、F、G、O，需采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿);編號K，需采用低速離心加培養(yǎng)基稀釋法0.5 mL/皿;編號 D、H、L、M、N，需采用低速離心加培養(yǎng)基稀釋法0.2 mL/皿;編號C、J，需采用低速離心加薄膜過濾法100 mL、編號B需200 mL、編號 P需300 mL;編號I，需采用薄膜過濾法(1∶100供試液1 mL過濾)100 mL、編號A需200 mL。

表1 十六個廠家復(fù)方丹參片常規(guī)法預(yù)試驗結(jié)果(n=3)

pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液作為稀釋劑的稀釋劑對照組回收率超過70%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對實驗無干擾。

4.3 霉菌和酵母菌數(shù)測定方法的確定 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選用白色念珠菌作為敏感菌株進行試驗，以確定霉菌和酵母菌數(shù)測定方法。按2.3項下操作，結(jié)果見表3。

編號 E、F、G、J、K、L、M、N、O、P 共 10 個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片，白色念珠菌采用常規(guī)法回收率大于70%;編號B、D、H采用培養(yǎng)基稀釋法0.5 mL/皿，編號 A、C、I需0.2 mL/皿其回收率也均大于70%。

4.4 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證 根據(jù)預(yù)試驗及細菌，霉菌、酵母菌方法確定結(jié)果，取16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片樣品，按藥典規(guī)定進行5種試驗菌的加菌回收率試驗驗證。

細菌計數(shù):

編號為E、F、G、O廠家的復(fù)方丹參片采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為 D、H、L、M、N 采用低速離心加培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為K采用低速離心加培養(yǎng)基稀釋法(0.5 mL/皿);編號為C、J、B、P采用低速離心加薄膜過濾法(分別為100 mL、200 mL、300 mL);編號為 A、I采用薄膜過濾法(1∶100供試液1 mL過濾，分別沖洗200 mL、100 mL)。

表2 敏感菌株(金黃色葡萄球菌)回收率試驗結(jié)果(n=3)

表3 敏感菌株(白色念珠菌)試驗結(jié)果(n=3)

表4 16個廠家復(fù)方丹參片驗證方法試驗結(jié)果(n=3)

霉菌及酵母菌計數(shù):

編號為 E、F、G、J、K、L、M、N、O、P 按常規(guī)法;編號為A、C、I按培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為B、D、H按培養(yǎng)基稀釋法(0.5 mL/皿)進行加菌回收率試驗。結(jié)果見表4。

16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片的方法驗證試驗結(jié)果表明，由于其抑菌作用強弱不同，需要分別采用不同的方法進行細菌數(shù)測定、霉菌及酵母菌數(shù)測定，5種規(guī)定試驗菌的回收率均大于70%，符合《中國藥典》的規(guī)定，方法可行。

4.5 控制菌檢查方法的驗證試驗結(jié)果 按藥典方法，分別取16個廠家樣品的1∶10供試液10 mL和1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌加入100 mL BL增菌液(常規(guī)法)進行控制菌大腸埃希菌驗證試驗;1∶10供試液1 mL和1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌加入10 mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)管中(常規(guī)法)進行控制菌大腸菌群驗證試驗，同時做相應(yīng)的陰性對照菌驗證試驗。結(jié)果為樣品試驗組都檢出大腸埃希菌、陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌，表明16個廠家的樣品控制菌檢查方法驗證試驗成立，實驗中同時取1∶10供試液10 mL或1 mL按常規(guī)法進行控制菌檢查，均未檢出大腸埃希菌和大腸菌群。

5 討論

5.1 在實驗過程中，采用常規(guī)法檢查時，16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片供試品對照組均無菌生長，當采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法檢查時，一些本身染菌的樣品在供試品對照組中檢出染菌數(shù)?？梢?，在試驗條件下不能有效地排除其抑菌作用，就無法檢查出樣品真實的污染菌數(shù)，根據(jù)2005版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證的回收率應(yīng)不低于 70%［1］附錄71。從表1 ～3 可見，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片對細菌和霉菌的抑菌作用強弱不同，需要采用不同的方法去消除其抑菌作用，才能有效檢出該藥品污染存活的細菌數(shù)量。

5.2 從表2結(jié)果看出，16個廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片，有4個廠家采用培養(yǎng)基稀釋法，6個廠家采用低速離心加培養(yǎng)基稀釋法，4個廠家采用低速離心加薄膜過濾法，另2個廠家采用薄膜過濾法(1∶100的供試液)，金黃色葡萄球菌的回收率才能大于70%。復(fù)方丹參片收載在《中國藥典》2005版一部，處方有丹參、三七、冰片3種中藥，其中丹參、冰片有抑菌作用，其處方、工藝已確定。從實驗結(jié)果得出，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片其抑菌強弱不同，尤其是對金黃色葡萄球菌抑菌作用差異顯著，估計主要原因是藥材產(chǎn)地、采收時間不同，丹參的質(zhì)量也不同。

5.3 編號為A、I廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片由于抑細菌作用太強，上述方法均不能排除其抑菌作用?！吨袊幍洹芬?guī)定［11］，若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗?？紤]到復(fù)方丹參片含有原生藥，標準規(guī)定細菌數(shù)為10 000個/g，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，將樣品制備成1∶100的供試液，取1 mL進行薄膜過濾。

5.4 由于復(fù)方丹參片具有較強的抗菌活性，通過預(yù)試驗結(jié)果，選擇金黃色葡萄球菌為細菌代表，白色念珠菌為真菌代表進行細菌、霉菌方法確定試驗，既節(jié)省了大量人力、物力，又能快速建立有效的微生物限度檢查方法。通常，當藥品生產(chǎn)條件發(fā)生改變(如更換產(chǎn)地、更換輔料和改變生產(chǎn)工藝等)或原檢驗條件發(fā)生改變時，對微生物限度檢查方法應(yīng)進行再驗證。由于進行再驗證時，藥品中的活性成分未發(fā)生改變，故其抗菌譜也未改變，因此我認為再驗證工作僅需針對藥典規(guī)定的全部驗證菌株中的最敏感菌株即可，而不必對全部菌株進行再驗證。采用這種方法，即可保證檢驗方法的有效性，又節(jié)省了大量人力、物力，使得驗證工作成為日常檢驗的一部分成為可能。建議藥典逐漸收載各抗菌藥物的最敏感驗證菌株作為質(zhì)控菌株，方便日常工作。

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