楊正望 ，文 炯 ，張增玲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南醴陵市中醫(yī)院，湖南 醴陵 412200）

補腎化瘀方對PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450表達的影響

楊正望1，文 炯2，張增玲2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南醴陵市中醫(yī)院，湖南 醴陵 412200）

目的 觀察補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達的影響。方法運用補腎化瘀方對PCOS模型大鼠進行干預(yù)后，采用免疫組化法觀察卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達。結(jié)果 模型組與正常組比較，卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達在表達面積及表達強度上均低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01)；補腎化瘀方中、高、低劑量組及媽富隆組用藥后，卵巢顆粒細(xì)胞的CYP450的蛋白表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05)；其中補腎化瘀方中劑量對PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達效果最佳。結(jié)論 補腎化瘀方能增強PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達，調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)分泌失調(diào)，改善PCOS高雄血癥，逆轉(zhuǎn)卵泡的發(fā)育異常，使排卵成功。

補腎化瘀方；補骨脂；菟絲子；澤蘭；細(xì)胞色素P450芳香化酶；多囊卵巢綜合征；大鼠；卵巢顆粒細(xì)胞

多囊卵巢綜合征 (Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)以持續(xù)不排卵和高雄激素血癥為最根本的特征,臨床表現(xiàn)有月經(jīng)不調(diào)、不孕、多毛、肥胖等,發(fā)病率約為10%,占不排卵性不孕的50%～70%。有研究表明，芳香化酶可使雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，而在PCOS患者中卵泡睪酮(T)／雌二醇(E2)比值升高，提示其芳香化酶作用的缺陷[1-2]。體內(nèi)積存過多的雄激素，引起卵泡閉鎖，無排卵，形成多囊卵巢（PCO）的一個重要指征。本文通過建立PCOS大鼠動物模型，將補腎化瘀方對其進行干預(yù)，采用免疫組化法檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞色素P450芳香化酶（CYP450）蛋白表達的影響，以期發(fā)現(xiàn)補腎化瘀方治療PCOS的作用靶點，為補腎化瘀方治療PCOS的作用機制提供實驗室依據(jù)。現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 取23日齡（斷奶后2 d）SD清潔級雌性大鼠 60 只，體質(zhì)量（41±42）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，（合格證號：醫(yī)動字20-004），清潔級飼養(yǎng)，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，噪聲小于60 Db。全價營養(yǎng)顆粒飼養(yǎng)，清潔飲用水。

1.1.2 藥物 補腎化瘀方：補骨脂12 g，菟絲子12 g，桑寄生 10 g，茺蔚子 15 g，丹參 10 g，澤蘭10 g，地龍 10 g，生雞內(nèi)金 6 g，甘草 3 g。對照藥物：媽富隆，荷蘭歐加農(nóng)公司生產(chǎn)（批號：160445）；丙酸睪酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司（批號：050108）；絨毛膜促性腺激素（HCG）：高科華泰制藥（批號：0605042）。

1.1.3 試劑 細(xì)胞色素P450免疫組化試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR1022）。

1.1.4 儀器 鼠用固定器，眼科解剖器械，醫(yī)用微波爐，光學(xué)顯微鏡（西德 XDS-1A）；OPTMA56.51圖像采集系統(tǒng)（德國Ziess）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 補腎化瘀方的制備:稱取原中藥材88 g，用水浸泡后濃煎取汁，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑實驗室統(tǒng)一制備成藥物濃度每毫升含生藥2.5、5、10 g低、中、高3個不同劑量，分別相當(dāng)于50 kg成人用藥等效劑量2.5、5、10倍。對照藥制備：將1片媽富隆溶于50 mL蒸餾水中，按50 kg成人用藥等效劑量0.6 mL/100 g灌服。

1.2.2 動物模型制備及分組 按文獻[3-4]使用雄激素聯(lián)合HCG制作大鼠PCOS病理模型，取23日齡（斷奶后2 d）SD清潔級雌性大鼠66只，以1∶5分為正常組和造模組，實驗組以頸背部皮下注射丙酸睪酮1.25 mg/只，隔日1次，同時給予HCG 1.5 u/只，每天2次皮下注射，連續(xù)20 d。造模結(jié)束后，正常組和造模組各隨機抽取2只大鼠，進行卵巢形態(tài)學(xué)檢測，根據(jù)兩組囊狀卵泡數(shù)目及卵巢局部有無黃體形成等，差異是否顯著，評定造模是否成功。造模成功后，造模組按隨機數(shù)字表法隨機分為5組：模型組、補腎化瘀方低劑量組（以下簡稱低劑量組）、補腎化瘀方中劑量組（以下簡稱中劑量組）、補腎化瘀方高劑量組（以下簡稱高劑量組）、媽富隆組，每天按時灌服補腎化瘀中藥高、中、低劑量和媽富隆，每日1次，給藥劑量均以50 kg成人體表面積換算，1 mL/100 g，灌胃21 d后停藥7 d，28 d為1個周期，共灌胃觀察3個周期。模型組和正常組，每天灌服等量蒸餾水，每日1次。

1.2.3 形態(tài)學(xué)檢測 藥物干預(yù)3個治療周期后，各組稱體質(zhì)量，實驗過程中，因灌胃操作不當(dāng)致大鼠死亡3只，實驗結(jié)束后，大鼠共59只，斷頭處死后，剖腹，每只大鼠取一側(cè)卵巢組織，4%多聚甲醛固定，HE染色行形態(tài)學(xué)檢查,光學(xué)顯微鏡下觀察卵泡及卵巢組織結(jié)構(gòu)。另一側(cè)卵巢組織免疫組化法檢測CYP450蛋白表達。實驗步驟按照說明進行。

1.2.4 免疫組化法 以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色及黃色顆粒為陽性反應(yīng)。根據(jù)染色強度，采用Image-Pro-Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)，測定卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞的陽性細(xì)胞個數(shù)、面積及光密度值(棕黃色處)，光密度值大(染色強度強)，則蛋白表達多，反之則表達少。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)輸入計算機，采用SPSS for Window 14.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料數(shù)據(jù)以 “”表示。采用單因素方差分析 (analysis of variance，ANOVA)進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 補腎化瘀方對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達的影響

模型組與正常組比較，大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達在表達面積及表達強度上均低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。補腎化瘀方中、高、低劑量組及西藥組，卵巢顆粒細(xì)胞的CYP450表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），說明補腎化瘀方高、中、低劑量組及西藥組對CYP450的蛋白表達都具有增強作用。其中補腎化瘀方中劑量對PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450的蛋白表達效果最佳。見表1～2。

表1 各組大鼠顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達密度比較（）

表1 各組大鼠顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達密度比較（）

注：與模型組比較 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與中劑量組比較 *P＜0.05。

組 別 n 藥物劑量(g/kg) 陽性細(xì)胞個數(shù)模型組 10 — 187.2±95.0正常組 9 — 577.8±213.3ΔΔ媽富隆組 10 2.1 391.9±232.4Δ*低劑量組 10 25 390.9±207.8Δ*中劑量組 10 50 577.4±256.6ΔΔ高劑量組 10 100 396.3±178.1Δ

表2 各組大鼠顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達強度的比較（）

表2 各組大鼠顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達強度的比較（）

注：與模型組比較 ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與中劑量組比較 *P＜0.05。

組 別 n藥物劑量(g/kg) 表達面積（μm2） 光密度值模型組 10 — 29.9844±7.5458 0.2017±0.0396正常組 9 — 54.6239±13.2208ΔΔ 0.3113±0.0513ΔΔ媽富隆組 10 2.1 43.2862±14.3542Δ* 0.2632±0.0641Δ*低劑量組 10 25 43.2805±13.4715Δ* 0.2630±0.0584Δ*中劑量組 10 50 54.6180±14.5574ΔΔ 0.3112±0.0571ΔΔ高劑量組 10 100 44.4543±10.6798Δ 0.2708±0.0408ΔΔ

2.2 補腎化瘀方對大鼠卵巢形態(tài)學(xué)的影響

正常組卵巢色澤紅，模型組卵巢表面較蒼白，體積增大，見較多囊狀擴張的卵泡。補腎化瘀方組卵巢色澤紅，未見囊狀擴張的卵泡。補腎化瘀方各組顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯增加,形態(tài)完整,排列整齊,泡膜細(xì)胞層明顯變薄。光學(xué)顯微鏡下：正常組可見多個不同發(fā)育階段的卵泡,卵母細(xì)胞發(fā)育正常，胞核與胞質(zhì)比例適當(dāng),透明帶完整,顆粒細(xì)胞呈多層,形態(tài)完整,排列整齊,卵泡膜細(xì)胞呈梭形排列；模型組可見卵巢白膜增厚,白膜皮質(zhì)下見多個卵泡囊性擴張及卵泡閉鎖,閉鎖卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞松散、腫脹,胞核固縮，顆粒層次減少,細(xì)胞固縮、壞死,呈深染色團塊狀,并可見少量中性粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞胞膜細(xì)胞增厚,卵泡腔內(nèi)胞漿嗜堿性增強；補腎化瘀方干預(yù)后的各組則顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯增加,形態(tài)完整,排列整齊,泡膜細(xì)胞層明顯變薄。見圖1。

圖1 補腎化瘀方對大鼠卵巢形態(tài)學(xué)影響的光鏡圖（HE染色×100）

3 討論

細(xì)胞色素P450芳香化酶能催化C19雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素合成的關(guān)鍵酶之一。CYP450在體內(nèi)多種雌激素合成部位表達，如卵巢顆粒細(xì)胞、脂肪組織和胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞等[5]。已證明P450芳香化酶mRNA在排卵婦女卵巢的排卵前卵泡和所有黃體細(xì)胞上均有表達，在卵泡刺激素(FSH)的調(diào)控下首先在卵巢顆粒細(xì)胞上表達基于卵巢甾體激素分泌的“兩種細(xì)胞，兩種促性腺激素”原理，黃體生成激素(LH)刺激卵泡膜細(xì)胞分泌雄激素，F(xiàn)SH影響下在顆粒細(xì)胞中雄激素芳香化為雌激素[6]。這種從雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)換是隨著卵泡在生長成熟過程中芳香化酶活性的增加而改變的。在PCOS患者，由于卵泡發(fā)育障礙，顆粒細(xì)胞較少，缺乏芳香化酶的活性，F(xiàn)SH的活性阻遏，不能充分將T轉(zhuǎn)化為E2，因此，易導(dǎo)致PCOS患者高雄激素血癥。

高雄血癥是PCOS患者較為突出的臨床特征，與其他臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，治療中降低雄激素是關(guān)鍵問題。對于伴高雄激素血癥的PCOS，補腎藥物在治療中占有十分重要的地位，在促進卵泡發(fā)育和排出中療效肯定[7]。腎虛總有瘀[8]?，F(xiàn)代研究已證實：補腎加活血可提高排卵率[9]。

本方由補骨脂、菟絲子、桑寄生、茺蔚子、丹參、澤蘭、地龍、生雞內(nèi)金、甘草組成。方中補骨脂功能溫補腎陽為君藥；桑寄生填精補血以滋補沖任之本，菟絲子功能補腎益精，健脾固任，既補腎陽，又滋腎陰，調(diào)理沖任，二藥共為臣藥。三藥合用，能使腎陰得養(yǎng)，腎陽得化。生殖之精充足，生殖之力充沛，卵子得以發(fā)育成熟。茺蔚子功能活血調(diào)經(jīng),丹參功能活血化瘀，理氣調(diào)經(jīng)，善調(diào)婦女經(jīng)水，為婦科要藥。地龍、澤蘭走沖任而活血利水，條達氣血，沖任通暢，卵子得以順利排出。生雞內(nèi)金可化瘀血，通經(jīng)絡(luò)。茺蔚子、丹參、澤蘭、地龍、生雞內(nèi)金共為佐藥，甘草調(diào)和諸藥為使藥。

本實驗旨在研究用補腎化瘀方對PCOS大鼠進行干預(yù)后，對PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450表達的影響，且進一步探討P450芳香化酶與PCOS卵泡發(fā)育的關(guān)系。結(jié)果表明PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞存在CYP450蛋白的異常低表達。補腎化瘀方能使PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP450蛋白表達水平增強，與正常組接近。提示補腎化瘀方可能通過增強CYP450在PCOS大鼠卵巢的表達，改善高雄激素血癥，從而促進卵泡的發(fā)育和卵巢的排卵。

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（本文編輯 彭芝配）

Effects of Bushen Huayu decoction on protein expression of CYP450 in ovarian granulosa cells in PCOS rats

YANG Zheng-wang,WEN jiong,ZHANG Zeng-ling
(First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To explore the effects of Bushen Huayu decoction(BHD)on protein expression of CYP450 in ovarian granulosa cells in PCOS rats.Method BHD was used to interpose the rats and the protein expression of CYP450 was determined with immunohistochemical method.Results Compared with normal group, the protein expression of CYP450 in model group was lower(P<0.01);and in high,middle and low dosages of BHD groups and western medicine group were obviously higher(P<0.01 or P<0.05),in which,in middle dosage of BHD group was best.Conclusion BHD can increase the protein expression of CYP450 in PCOS rats,regulate the maladjustment of incretion balance and improve hyperandrogenemia,restore the abnormal growth of folliole and ensure the success of ovulation.

Bushen Huayu decoction;semen psoraleae;semen cuscutae;herba lycopi;aromatase cytochrome P450;polycystic ovary syndrome;rats;ovarian granulosa cells

楊正望(1963-)，女，湖南桃江人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)藥治療多囊卵巢綜合征研究。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.008.030.03

2010－09－08

湖南省自然科學(xué)基金資助項目(05JJ40027)。