劉 巖， 張春陽， 張大田， 姜華茂

(遼寧醫(yī)學院附屬一院泌尿外科，遼寧錦州121001)

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃curcuma longa根莖中提取的一種酚性色素。其中醫(yī)性味歸經屬辛、苦、溫。歸脾、肝經，用于胸脅刺痛、閉經、風濕肩臂疼痛等［1］。姜黃的化學成分主要為姜黃素類及揮發(fā)油兩大類，此外尚有糖類、甾醇等。姜黃素類化合物(curcumins)是中藥姜黃的主要有效成分，含量約占3% ～6%，主要包括姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxy curcumin)和去二甲氧基姜黃素(bisde-methoxy curcumin)3種。晶體姜黃素為淡黃色粉末，含量≥90%，溶于乙醇、丙酮、乙二醇及堿性溶液;不溶于水、乙醚;微溶于植物油［2］。姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗動脈粥樣硬化的作用。Siddiqui等［3］在巨噬細胞系RAW264.7細胞中發(fā)現(xiàn)用50 μM和100 μM姜黃素預處理的細胞比單純用脂多糖處理的細胞PPAR-γmRNA表達水平分別增加86%和125%，從體外實驗表明姜黃素可通過上調PPAR-γ發(fā)揮抗炎作用。Kowluru［4］等研究顯示姜黃素能明顯阻止糖尿病導致的抗氧化能力減弱，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，其機制是姜黃素能抑制氧化DNA在視網(wǎng)膜的積聚和提高GSH水平。Punithavathi等［5］在胺碘酮誘導的動物肺纖維化模型的研究中證實，應用姜黃素對肺纖維化具有治療作用，姜黃素可降低肺纖維化模型大鼠支氣管肺泡灌洗液的細胞總數(shù)和蛋白總量，以及乳酸脫氫酶活性，抑制肺髓過氧化物酶的活性。Yuan HY等［6］研究發(fā)現(xiàn)在血管平滑肌細胞中，姜黃素能通過抑制膽固醇調節(jié)元件結合蛋白-1核轉位增加小凹蛋白-1的表達，從而阻止氧化修飾型LDL引起的膽固醇積聚。此外，姜黃素還可下調HIV相關細胞因子的表達，抑制HIV患者B細胞淋巴瘤的增殖［7］。腎癌是泌尿系常見的惡性腫瘤，腎癌的發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢，轉移性腎癌手術死亡率為2% ～11%［8］。腫瘤的侵襲與轉移影響著腫瘤患者的預后，抑制腫瘤的侵襲和轉移是治療腫瘤的重要靶點。本研究通過體外實驗研究姜黃素對腎癌細胞凋亡的影響和對腎癌細胞外基質蛋白酶MMP2、MMP9的表達效應，研究其誘導腎癌細胞凋亡及抗侵襲作用的可能機制，為腎癌的臨床藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及細胞株 姜黃素經HPLC檢測，購自上海友思生物技術公司;786-О(人)腎透明細胞癌，購自北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞所。

1.1.2 主要化學試劑 鼠抗人MMP2/MMP9單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術公司;TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒，購自美國Roche公司。

1.1.3 主要儀器 美國BeckmanCoulter流式細胞儀，型號:EPICSFC500;BG-subMIDI多用途水平電泳儀，Baygene美國。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞分析 取對數(shù)生長期的786-О細胞，調細胞數(shù)為5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L 不同濃度的姜黃素溶液，每個濃度3復孔，設不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48 h。流式細胞儀檢測、制片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 TUNEL技術 取對數(shù)生長期的786-О細胞，調細胞數(shù)為5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L 不同濃度的姜黃素溶液，每個濃度3復孔，設不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48 h。取出載玻片，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，封閉內源性過氧化物酶，滴加TUNEL混合反應液50 μL(酶溶液與標記溶液按照1∶9體積混合)，置濕盒37℃孵育60 min，同時以標記溶液代替反應溶液作為陰性對照滴加POD液50 μL，置濕盒37℃孵育30 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液50 μL，中性樹膠封片。

1.2.3 DNA片段瓊脂糖凝膠電泳 取對數(shù)生長期的786-О細胞，調細胞數(shù)為 5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L不同濃度的姜黃素溶液，每個濃度3復孔，設不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)48h終止后，PBS洗2次，加入2 mL細胞裂解液(50 mmol/L tris·HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，2%SDS和0.01%(w/v)蛋白酶K)，混勻，37℃水浴18 h后，再加入0.8 mL飽和NaCl溶液并37℃水浴5 min，經3 000 r/min離心1 h后，取上清液加入RNA酶(20 mg/L)，37℃水浴15 min，用2倍體積無水乙醇-20℃過夜沉淀DNA，取2 μL在1.25%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 Western blot分析MMPs表達 取對數(shù)生長期的786-О 細胞，調細胞數(shù)為 5 ×106/mL，分別加入 5、10、20、40 μmol/L不同濃度的姜黃素溶液，每個濃度3復孔，設不加任何藥物的對照組，培養(yǎng)24 h。按分子克隆實驗指南方法提取總蛋白，取10 μL樣品稀釋10倍后進行蛋白定量，并統(tǒng)一調整樣品蛋白濃度為500 μg/mL，樣品分裝后-80℃保存?zhèn)溆?。配膠，點樣，電泳，轉膜(半干法轉移)，封閉，結合一抗，結合二抗，顯色:NBT/BCIP顯色，5～30 min，肉眼觀察出現(xiàn)特異性條帶顯藍黑色，反應終止，用PBS終止反應。應用掃描軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。以鼠抗人β-actin(橫紋肌纖維和細胞細絲的蛋白質組分)抗體作為一抗進行Western blot檢測，作為判斷結果的內參照。

2 結果

2.1 對細胞凋亡率的影響 流式細胞儀與TUNEL結果顯示:四個不同劑量之間凋亡率有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

表1 不同濃度姜黃素對人腎癌786-О細胞凋亡率的影響(n=3，±s)

表1 不同濃度姜黃素對人腎癌786-О細胞凋亡率的影響(n=3，±s)

注:每個濃度組與前一個濃度組相比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

姜黃素含量/(μmol/L)凋亡率/%FCM TUNEL 0 6.52±0.42△△ 2.23±0.14△△10 8.46±0.45△△ 5.12±0.21△△20 10.21±0.50△△ 8.73±0.32△△40 12.37±0.55△△ 11.25±0.46 0.61±0.17 0.44±0.22 5△△

2.2 DNA片段瓊脂糖凝膠電泳結果 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，20 μmol/L和40 μmol/L的姜黃素溶液處理得786-О細胞后可見凋亡特征性的DNA梯形條帶出現(xiàn)，隨濃度升高而更加清晰。表明姜黃素可使得在786-О細胞的核小體連接處的DNA隨機切斷，形成寡聚核小體。

2.3 Western blot結果 蛋白電泳條帶顯示，隨姜黃素濃度的逐漸增加，條帶的灰度逐漸降低。用目的條帶與內參照條帶的比值代表目的蛋白的表達水平進行分析，MMP2及MMP9組中各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 不同濃度姜黃素作用人腎癌786-О細胞后目的條帶與內參照條帶比值(n=3，±s)

表2 不同濃度姜黃素作用人腎癌786-О細胞后目的條帶與內參照條帶比值(n=3，±s)

注:每個濃度組與對照濃度組相比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;每個時間段與前一個時間段相比較，*P＜0.05。

姜黃素含量/(μmol/L)基質金屬蛋白酶內參照條帶比值/%MMP2 MMP9 0 83.23±4.21△* 78.29±10.79△*10 79.65±9.45△ 61.27±15.30△△*20 62.62±1.75△△* 42.55±2.13△△*40 54.43±13.97△△ 22.32±7.34 98.48±2.63 98.76±3.03 5△△*

3 討論

腎癌的主要治療方法是外科手術，對化療、放療、激素治療均不敏感。因此，探索新的治療方法和開發(fā)低毒而療效明顯的藥物已成為目前腎癌治療領域研究的重點和熱點。近年研究表明，姜黃素對 HL-60、K562、SGC-7901、Bel-7402、MGC-803等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用［9-11］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞增殖失控和細胞凋亡減少有關，抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡是藥物治療腫瘤最重要的機制之一［12］。本研究表明，姜黃素可誘導以人腎癌786-О細胞的凋亡，且呈濃度依賴性。DNA片段瓊脂糖凝膠電泳結果表明姜黃素可使在786-О細胞的核小體連接處的DNA隨機切斷，形成寡聚核小體，誘導凋亡。

腫瘤的侵襲轉移過程十分復雜，這一過程主要包括了腫瘤細胞之間、腫瘤細胞與宿主之間、腫瘤細胞與細胞外基質之間的相互作用。本實驗中人腎癌786-O細胞在不同濃度姜黃素作用24 h后，蛋白電泳條帶顯示，隨姜黃素濃度的逐漸增加，MMP2及MMP9條帶的灰度逐漸降低。用目的條帶與內參照條帶的比值代表目的蛋白的表達水平進行分析，MMP9組中各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義，姜黃素可以下調MMP9在人腎癌786-O細胞中的表達，且呈劑量反應關系。經比較分析，也可以看出在MMP2組中MMP2在人腎癌786-O細胞中的下調表達的趨勢，且呈一定的劑量反應關系。由此可以得出初步結論，姜黃素可以下調基質蛋白酶MMP9及MMP2的表達，起到抗腫瘤侵襲的作用。姜黃素具有抑制腫瘤侵襲與轉移作用，有可能成為一種具有臨床應用價值的抗腫瘤侵襲與轉移的藥物。

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