陶勝忠 尹先印 牛光明 張鵬遠(yuǎn)

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450014

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射前后ATM蛋白的表達(dá)及ATM/PI3-K區(qū)突變檢測(cè)

陶勝忠 尹先印 牛光明 張鵬遠(yuǎn)

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450014

目的探討多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞輻射前后ATM蛋白表達(dá)量的變化及ATM/PI3-K區(qū)基因突變的情況。方法采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞系及5例原代培養(yǎng)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以2 Gy射線劑量照射前后ATM蛋白表達(dá)量的變化,以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法,對(duì)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中ATM/PI3-K區(qū)關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行突變檢測(cè)。結(jié)果U 251細(xì)胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明顯低于原代培養(yǎng)GBM的ATM蛋白量,U 251和原代GBM細(xì)胞ATM蛋白表達(dá)量有顯著差異(P＜0.05);U 251細(xì)胞系及原代培養(yǎng)GBM細(xì)胞60Co照射后的ATM表達(dá)雖有所升高,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。所測(cè)U 251細(xì)胞系及5例原代培養(yǎng)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中ATM/PI3-K區(qū)序列中未檢測(cè)到基因突變。結(jié)論ATM蛋白表達(dá)水平不能完全反映ATM蛋白激酶的活性,多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的放射抗拒可能與ATM/PI3-K區(qū)基因突變不相關(guān)。

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;A TM蛋白;A TM/PI3-K

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gliob lastomamu ltiforme,GBM)是腦膠質(zhì)瘤中惡性程度極高的一類腫瘤,手術(shù)難以全切,術(shù)后易復(fù)發(fā)且對(duì)放射治療不敏感,預(yù)后不良。GBM對(duì)放射抗拒的機(jī)制尚不清楚。研究表明[1-2],ATM(ataxia telangiectasiamutated,ATM)基因是對(duì)電離輻射高度敏感的共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的唯一致病基因,其 PI3-K(phosphatidylinositol-3-kinase)功能區(qū)的突變會(huì)引起細(xì)胞放射敏感性的改變。為探討GBM對(duì)放射治療抗拒的原因,我們采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)了U 251細(xì)胞系和5例原發(fā)GBM60Co照射前后ATM蛋白量的變化,并采用RT-PCR和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法,對(duì)其ATM/PI3-K關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行了突變檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及主要儀器 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U 251由武漢大學(xué)典型物保藏中心提供。5例原發(fā)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤均經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查證實(shí)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及照射 U251細(xì)胞系及5例GBM采用RPM I-1640培養(yǎng)基,pH值7.4,含10%小牛血清,青鏈霉素各100 IU/m L,處于指數(shù)生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代,細(xì)胞密度為1×106/m L接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育過夜,用60Co治療機(jī)以2Gy放射劑量進(jìn)行照射,并于照射后4 h、24 h收取細(xì)胞。照射前后細(xì)胞以75%冰乙醇固定,至于-80℃冰箱待用。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)60Co照射前后ATM蛋白表達(dá)量ATM鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自晶美生物有限公司,FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及Triton、BSA等試劑購(gòu)自武漢凌飛科技有限公司。應(yīng)用FACSort流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),以488 nm激光激發(fā),應(yīng)用Mod LTFit 2.0軟件進(jìn)行ATM蛋白表達(dá)含量的分析。設(shè)立用PBS代替一抗的陰性對(duì)照及正常對(duì)照。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及產(chǎn)物序列分析 根據(jù)Genbank Database中ATM基因mRNA序列,應(yīng)用PRIMER 5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)A TM主要功能區(qū)PI3-K區(qū)的引物。引物序列為：上游引物5'-CAGTGCCTTTCAGTGCCAAA-3',下游引物 5'-GTTTCATCTTCCGGCCTCTG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物為546 bp,內(nèi)參照為β-action。引物及內(nèi)參均由上海博亞生物技術(shù)公司合成。PCR產(chǎn)物序列分析由上海博亞生物技術(shù)公司完成。

2 結(jié)果

2.160Co照射前后ATM 蛋白表達(dá)量 U 251細(xì)胞系中60Co照射前后ATM 蛋白量均明顯低于原代培養(yǎng)GBM的ATM 蛋白量(P＜0.05)。U251細(xì)胞系及原代培養(yǎng)GBM細(xì)胞60Co照射后的ATM 蛋白表達(dá)水平雖有所升高,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 U 251細(xì)胞系和原代培養(yǎng)GBM放射前后的ATM平均蛋白熒光強(qiáng)度

2.2 ATM mRNA表達(dá)量 紫外分光光度儀測(cè)定mRNA純度：A 260/280∶1.8～2,提取的 mRNA經(jīng) RT-PCR后出現(xiàn)特異性的DNA條帶。U251和原代GBM細(xì)胞ATM半定量RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果：其ATM m RNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.327±0.047和0.758±0.091,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,U251和原代GBM細(xì)胞ATM m RNA表達(dá)量有顯著差異(P＜0.05)。

2.3 DNA序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)正反序列分析,結(jié)果與基因庫(kù)中ATM序列完全一致。

3 討論

ATM蛋白是輻射反應(yīng)金字塔的中樞成分之一,可以早期感知輻射所致?lián)p害和啟動(dòng)檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)的功能,激活的ATM蛋白觸發(fā)其下游通路并調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等特異的生化和細(xì)胞反應(yīng)。ATM蛋白激酶是ATM蛋白的活性形式,該激酶與DNA輻射損傷后修復(fù)緊密關(guān)聯(lián),其活性改變引起DNA修復(fù)進(jìn)程的中斷可能是導(dǎo)致放射高敏感性的重要原因[3]。一旦暴露于離子射線,ATM蛋白激酶活性可被立刻激活,并導(dǎo)致許多涉及DNA修復(fù)、凋亡及細(xì)胞周期阻滯的關(guān)鍵靶基因的磷酸化作用[4]。

為此,我們采用流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)了來(lái)源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的U 251細(xì)胞系和5例原發(fā)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤60Co照射前后ATM蛋白量的變化以期了解輻射對(duì)ATM蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),U 251細(xì)胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明顯低于原代培養(yǎng)GBM的ATM蛋白量,多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在遭受2 Gy放射劑量照射后,ATM蛋白表達(dá)水平雖有所升高,但與照射前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。文獻(xiàn)報(bào)道,遭受輻射后ATM表達(dá)水平并未改變,但激酶活性卻可增加數(shù)倍[3]。對(duì)正常人淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期各時(shí)相特異的ATM激活 TP53-15絲氨酸磷酸化的研究顯示,ATM蛋白激酶活性在細(xì)胞受電離輻射后立即上升,但和ATM蛋白量變化并不一致[15]。因而,我們認(rèn)為ATM蛋白表達(dá)水平并不能完全反映其激酶活性,目前尚不清楚ATM如何被激活,可能與輻射后ATM的磷酸化及構(gòu)象改變修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

已建系的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在生物學(xué)特性上與體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞有較大差異,原代培養(yǎng)的細(xì)胞則不同,由于細(xì)胞剛剛離體,生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍具有腫瘤細(xì)胞的遺傳物性,很接近體內(nèi)的生長(zhǎng)特性,即使組織類型、部位相同,個(gè)體差別也可以在培養(yǎng)的細(xì)胞上反映出來(lái)[4]。我們的結(jié)果顯示了U 251細(xì)胞系和原代培養(yǎng)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤ATM蛋白表達(dá)水平的差異(P＜0.05)。

到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上百種ATM基因的突變類型,這些突變分布于ATM基因全長(zhǎng)序列中,其中絕大多數(shù)突變表現(xiàn)為整個(gè)ATM基因的截短或大片斷缺失,從而導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物失活[6]。PI3-K片斷是ATM基因mRNA編碼ATM蛋白關(guān)鍵活性區(qū)域的序列,抑制該區(qū)域蛋白翻譯可以滅活A(yù)TM的功能。在放射等細(xì)胞DNA損傷條件下,ATM的PI3-K可作為細(xì)胞的生存因子降低細(xì)胞對(duì)放射線及類射線細(xì)胞毒藥物的敏感性[7]。我們結(jié)合文獻(xiàn)選擇了作為ATM基因mRNA編碼ATM蛋白PI3-K區(qū)關(guān)鍵區(qū)域序列(8578～9123 nt,546 bp)為靶點(diǎn),應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法獲得ATM/PI3-K區(qū)域編碼序列的cDNA片段,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。結(jié)果表明,在 U 251細(xì)胞株和原代培養(yǎng)的GBM細(xì)胞中,均未發(fā)現(xiàn)ATM/PI3-K區(qū)域的序列性突變。但由于ATM基因編碼序列有12 kb,其中PI3-K區(qū)全長(zhǎng)為1.2 kb[8],本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了ATM基因m RNA編碼ATM蛋白PI3-K區(qū)關(guān)鍵區(qū)域546 bp,因此不能排除ATM其他區(qū)域發(fā)生突變而影響其放射敏感性的可能性;另一方面,細(xì)胞的放射敏感性的改變涉及多種分子生物學(xué)過程[21-22],所以ATM基因突變以外的因素也可影響其放射敏感性。

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ATM protein levelbefore and after radiation and genemutation of ATM/P-I3K region in glioblastomam ulti-form e cell

Tao Shengzhong,Yin X ianyin,N iu Guangm ing,eta l.Departmentof Neurosurgery,the Second A f f iliated Hosp italof Zhengzhou University,Zhengzhou450014,China

ObjectiveG lioblastomamu ltiforme(GBM)is one of themalignanciesmost resistant to radiation therapy.The aims ofour study w ere as follow s：firstly,quantify ATM protein level in GBM before and after radiation;second ly,detection of ATM genemutation to define the correlation betw een g liob lastoma multiforme cell radiosensitivity and gene mutation in the ATM/PI3-K coding region.M ethods ATM p rotein level in U 251 cell line and 5 cases primary cu ltureof GBM beforeand after radiation w ere determ ined by Flow cytometry;RT-PCR was used to get a 546bp fragmentof ATM cDNA form U251 cell line and p rimary culture of GBM,containing the phosphatidy linositol-3-kinase(PI3-K).Direct sequencing of RT-PCR p roductw as app lied to determ ine themutations in the gene.Resu lts In the U251 cell line and 5 cases primary cu lture of GBM,the authors demonstrated a transient increase in theexpression of A TM protein level after radiation,ATM protein can be up-regulated in response to radiation,but w ith no statistic difference(P＞0.05);U 251 cell line exp ressed ATM p rotein and ATM m RNA at considerably lower levels than primary tumors(P＜0.05).The sequenceof the 546bp fragment was identical to thoseof ATM gene published in gene bank.No genemutation was detected in the ATM/PI3-K region of GBM.ConclusionThe activity of ATM p rotein kinase is not associated with the expression levels of ATM p rotein.It indicates that there are no correlations betw een themutation of ATM/PI3-K and the radiosensitivity in GBM.The radiosensitivity of GBM may depend on some other factors and w ithout being related to ATM/PI3-K mutations.

GBM;A taxia telangiectasiamutated protein;ATM/PI3-K

R730.264

A

1673-5110(2011)09-0001-03

河南省青年骨干教師項(xiàng)目資助

book=3,ebook=190

(收稿2011-04-03)