趙偉霞 趙丁源

家兔克隆骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)

趙偉霞 趙丁源

目的探討家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外傳代的培養(yǎng)。方法取家兔股骨骨髓，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，于1640培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，之后固定計(jì)數(shù)。結(jié)果在2～6×106個(gè)/cm2范圍內(nèi)，其接種細(xì)胞數(shù)與所形成的克隆集落(CFU-F)數(shù)呈良好線性關(guān)系。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，克隆集落也增多，變大。3周齡家兔的造血基質(zhì)祖細(xì)胞較6周齡者為多。結(jié)論基質(zhì)祖細(xì)胞CFU-F呈非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。

家兔;骨髓;造血基質(zhì)祖細(xì)胞;克隆

骨髓基質(zhì)細(xì)胞是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的內(nèi)環(huán)境主要細(xì)胞成分［1］。曾對(duì)小鼠體外單層培養(yǎng)造血基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)其接種的細(xì)胞數(shù)與成集落數(shù)呈良好的線性關(guān)系［2］。目前對(duì)家兔的骨髓器官基質(zhì)細(xì)胞的研究國(guó)內(nèi)研究有過報(bào)道［3］。本文用體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞技術(shù)［4］對(duì)家兔的骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 材料來(lái)源 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心飼養(yǎng)的雌雄兩性、3～6周齡之純種家兔。

1.2 主要試劑與器材 RPME1640培養(yǎng)液，小牛血清(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，平底中性玻璃培養(yǎng)瓶，二氧化碳孵箱，微孔濾網(wǎng)。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞制備 6周齡家兔用乙醚麻醉處死;3周齡者則用頸椎脫臼致死。在無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨修潔后剪掉骺端，用帶16號(hào)針頭注射器以1640培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，再用濾網(wǎng)過濾制取單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用所需細(xì)胞量進(jìn)行體外CFU-F培養(yǎng)。

1.4 CFU-F培養(yǎng)和測(cè)定 將6周齡家兔的骨髓細(xì)胞以2×106個(gè)/cm2，3周齡的以2～6×106個(gè)/cm2置于含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系的培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液換液，培養(yǎng)到第八天沖洗后用甲醛固定半小時(shí)，蒸餾水沖洗后用姬姆薩染色12 min后晾干，待計(jì)數(shù)用。

2 結(jié)果

2.1 CFU-F克隆集落形成過程觀察 于培養(yǎng)第4天在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)淡紅色背景下(紅細(xì)胞)有圓形發(fā)亮的較大基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，拉長(zhǎng)的細(xì)胞較少見，振蕩后觀察未見發(fā)亮細(xì)胞浮起，說明細(xì)胞已貼壁。培養(yǎng)第六天鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞明顯增多，拉長(zhǎng)者較多，形成了克隆集落，6周齡的骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于3周齡者，且培養(yǎng)同天數(shù)的6周齡的克隆集落數(shù)明顯低于3周齡的克隆集落數(shù)。

2.2 CFU-F計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)由50個(gè)以上細(xì)胞所形成的集落數(shù)，結(jié)果如圖1、2和表1。由50～99個(gè)細(xì)胞組成的集落為小集落，由100～199個(gè)細(xì)胞組成的集落為中集落，＞200個(gè)細(xì)胞者的為大集落。

3 討論

從以上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，形成克隆集落相對(duì)越多，3周齡者，骨髓細(xì)胞較多，造血基質(zhì)祖細(xì)胞也較多，形成的克隆集落數(shù)也多。在2～6×106個(gè)/cm2范圍內(nèi)，形成的克隆集落數(shù)與種植細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

通過對(duì)集落大小，所含細(xì)胞數(shù)與密度比較，表明CFU-F非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。這對(duì)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的增殖與分化有一定的指導(dǎo)意義。

圖1 家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞集落

圖2 接種的3周齡家兔細(xì)胞數(shù)和集落單位之間的線性關(guān)系

表1 家兔骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的集落數(shù)(±s)

表1 家兔骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的集落數(shù)(±s)

經(jīng)檢驗(yàn)，P＜0.01

兔齡(周數(shù)) 接種細(xì)胞數(shù)(106)集落數(shù)大集落 中集落 小集落6 11±2.1 21±2.9 25±3.1 3 2 13±2.0 18±2.3 37±3.0 2 3 4 23±2.2 42±5.5 80±9.3 34±6.5 64±10.2 102±12.8 3 6

［1］姚程，彭麗萍，姜振宇，等．骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外擴(kuò)增能力及支持造血的研究．白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，17(4):386-388．

［2］于洪臣，郭占之，畢曉穎，等.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，17(3):219．

［3］王春艷，何欣，李增新，等．兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)研究．北華大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，6(6):520-522．

［4］蔡國(guó)鋒，黃開，章慶國(guó)．兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究．東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(1):16-19．

The culture of colonies of rabbit bonem arrow strom al cell in vitro

ZHAOWei-xia，ZHAO Ding-yuan.Institute for Environmental Health and Related Product Safety，Chinsese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100021，China

ObjectiveTo investigate the growing variation of the culture of colonies of rabbit bone marrow stomal cell in vitro.MethodsExtracted rabbitbonemarrow stomal cell，then cutlured these cell isolated in 1640 cultre system of CO2incubator.Count the colony after fixed.ResultsTherewas a clearly linear relationship between the number of implanted cells and the formed colonies in a some concentration(2～6×106/cm2)，and the colonies of bonemarrow stromal cell were increasing with the time extending.The CFU-F of the three weeks rabbitweremore than that of the six weeks rabbit.ConclusionThe CFU-F are nonhomogenous，and might be heterogeneous subgroups．

Rabbit;Bonemarrow;Hematopoietic matrix grand mother cells;Colony

100021 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所(趙偉霞);湖北省武漢疾控中心(趙丁源)