崔 娓

（珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東 珠海 519001）

C反應蛋白（C reation protein，CRP）是一種急性時相反應蛋白，在急性和慢性感染、創(chuàng)傷、腫瘤、心肌梗塞時其血濃度急劇升高，檢測CRP對臨床診斷有重要參考價值[1]。目前，我國臨床實驗室測定血清特定蛋白的方法主要有兩種，一種為透射比濁法，另一種為散射比濁法。西門子BNII全自動特定蛋白分析儀用散射比濁法測定CRP，國內較少應用此方法。筆者參考美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)文件及相關文獻并結合實際工作[2-4]，探討了DADE Behring Nephelometer II(BNII)散射比濁法檢測CRP的方法學性能驗證方案和評價方法，結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 BNII全自動特定蛋白分析儀，西門子原裝CRP試劑、校準品，低、高值質控品，Roche Modular全自動生化分析儀，羅氏原裝CRP試劑、校準品，質控品，Sysmex A-PLUS干擾試劑盒。

1.2 標本 標本來源于就診患者新鮮血清、無溶血、黃疸和脂血。

1.3 評價方案

1.3.1 精密度核實實驗[5]按照操作說明書對儀器進行維護保養(yǎng)、校準和質量控制，按EP-15A文件要求計算需要重復測試的天數和次數(如果σwithin＜2/3σtotal實驗應持續(xù)5 d，每批每個水平重復測定4次；如果σwithin＞2/3σtotal實驗應持續(xù)3 d，每批每個水平重復測定3次；如果σwithin與σtotal相對關系未知，每個水平重復4次，持續(xù)5 d。σwithin和σtotal分別用來表示廠家聲明的批內標準差和總標準差），按上述設計的天數和重復次數測定標本，將結果詳細記錄并依文件進行數據處理，分別計算Swithin和Stotal(Swithin和Stotal分別用來表示用戶測定的批內標準差和總標準差)，與廠家聲明的σwithin和σtotal進行比較。核實批內精密度：如果Swith＜σwithin，用戶核實了與廠家聲明一致的精密度；如果Swith＞σwithin，有可能這種差異無統計學意義，需要進行驗證，若Swith小于驗證值，廠家聲明的批內精密度通過驗證。核實總精密度：如果Stotal＜σtotal，用戶核實了與廠家聲明一致的精密度；如果Stotal＞σtotal，有可能這種差異無統計學意義，需要進行驗證，若Stotal小于驗證值，廠家聲明的批內精密度通過驗證。

1.3.2 準確度核實實驗 用批號為183843的校準品校準檢測系統后，在對同一批號和不同批號(183842)的校準品進行檢測，檢測結果與各自的標示值(靶值)進行比對(2個批號校準品均為儀器配套校準品，其校準值可溯源至WHO中人CRP參考資料)。

1.3.3 比對實驗[6]每天選取8份臨床患者新鮮樣本，分別在羅氏Modular PPI全自動生化分析儀和西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀上按1→8再8→1的順序進行CRP的雙份平行測定，分5個工作日完成40份樣本的測定。組內離群值檢查:以絕對差值均值的4倍作為每個檢測方法的“可接受”限，以相對差值均值的4倍作為標準化的檢測界限，如果有一個值超過上述“可接受”限或相對范圍的檢測界限，檢查原因，并從數據中刪除此值。從數據中刪除的離群值不得超過一個。數據作圖：以待評方法(BNⅡ)的結果為Y，以比較方法(羅氏)的結果為X做散點圖。方法間離群值檢查：分別以4ē和4ē'作為檢測限和相對檢測限，任何一點入未通過上述兩種檢測限，則判斷為離群值。每組數據中被刪除得離群值不能超過2.5%。X值合適范圍檢驗：計算r或r2，如果r≥0.975(r2≥0.95)，則可認為X值取值范圍合適。如果r＜0.975，則使用部分個別差異法計算平均偏差。計算兩種方法的線性回歸方程，結果解釋：估算CRP在兩個不同醫(yī)學決定水平(12 mg/L和20 mg/L)的預期偏差、相對偏差和預期偏差95%的可信區(qū)間。以1/2 CLIA’88允許誤差作為臨床可接受標準，計算醫(yī)學決定水平(Xc)的允許誤差(EA)，將預期偏差的可信區(qū)間與醫(yī)學決定水平的EA相比較：當EA＞預期偏差可信區(qū)間的上限時，實驗方法與對比方法相當，偏差可以接受；當預期偏差可信區(qū)間的上限＞EA＞預期偏差可信區(qū)間的下限時，實驗方法與對比方法相當；當EA＜預期偏差可信區(qū)間的下限時，實驗方法與對比方法不相當，偏差不能被接受。

1.3.4 干擾實驗 參考EP7-A2文件[7]，首先進行配對差異實驗，即將陽性干擾物加入測定樣品中，與不加的對照組比較有無偏倚。如果無臨床顯著意義，則該物質不是干擾物，無須進一步實驗；反之具有臨床顯著意義的，應進行干擾劑量效應評價實驗以確定干擾物濃度與干擾程度間的關系。

1.3.4.1 配對差異實驗 實驗材料：(1)基礎樣本：依據EP7-A2推薦的分析物濃度，CRP選擇約10 mg/L和40 mg/L的新鮮血清(無溶血、黃疸和脂血)作為基礎樣本，并重復測試10次，得到均值和批內標準差S。(2)貯存液和空白液：A-PLUS試劑盒內含游離膽紅素(F-Bil)、結合膽紅素(C-Bil)、血紅蛋白(Hb)、乳糜4種干擾物和空白對照凍干粉，復溶后分別作為貯存液和空白液。(3)測試樣本和對照樣本：依據實驗要求，用基礎樣本分別以1∶9、1∶5、1∶10、1∶20比例稀釋4種干擾物的貯存液和空白液作為測試樣本(C)和對照樣本(T)，其中F-Bil、C-Bil、Hb添加的量為樣本中可能出現的最高濃度。

1.3.4.2 重測次數n的確定(95%的置信區(qū)間)首先計算dmax/s(最大允許干擾值/批內標準差)比值，然后查表1，獲得實驗需要的重測次數n。

表1 dmax/s與重測次數對應表

1.3.4.3 點估計 將所得數據進行干擾效應的“點估計”，即dobs(dobs=X檢測－X對照)與臨界值dc比較，如果點估計dobs≥dc，說明存在干擾。

1.3.4.4 干擾劑量效應實驗 如果配對差異實驗存在干擾現象，利用5個系列濃度(L、75%L+25%H、50%L+50%H、25%L+75%H、H)確定其劑量效應關系。

2 結 果

2.1 精密度核實試驗結果 參考EP-15A，由于CRP檢測項目的σwithin與σtotal相對關系未知，則取高低兩個水平的質控品，每個水平重復4次，持續(xù)5 d。低水平濃度質控品Swithin和Stotal分別為0.46和0.58，批內CV和總CV分別為3.32%和4.19%；批內高水平濃度質控品Swithin和Stotal分別為1.99和2.53，批內CV和總CV分別為3.58%和4.55%。見表2。

2.2 準確度核實試驗 2個批號校準品的驗證值和靶值的相對偏差在6.05%～6.16%，見表3。

2.3 比對實驗 兩種方法內和方法間離群點：CRP方法內和方法間各有一離群點，按文件要求刪除。相關性：按EP9-A2文件要求，繪制透射比濁和散射比濁兩種方法測定CRP的散點圖。兩種方法的相關性較好，相關系數r為0.999 5，線性回歸方程為y=0.952 7x+0.355 2(圖1)。偏差：在醫(yī)學決定水平1(12 mg/L)，預期偏差和相對偏差分別為-0.21和1.77%，預期偏差的95%可信區(qū)間為10.81～12.76；在醫(yī)學決定水平2(20 mg/L)，預期偏差和相對偏差分別為-0.59和2.95%，預期偏差的95%可信區(qū)間為18.43～20.38，見表4。

表2 精密度實驗結果(mg/L)

表3 校準品驗證結果(mg/L)

圖1 待評方法（BNII）均值對比較方法（Roche）均值的散點圖

表4 CRP測定的臨床可接受性能評價

2.4 干擾實驗 本實驗設定基礎樣本均值的12.5%為dmax，查dmax/s表可得n=3。配對差異實驗的結果顯示，F-Bil 0.2 g/L、C-Bil 0.4 g/L、Hb 4.82 g/L、乳糜835濁度對CRP檢測時干擾差異無統計學意義(P＜0.05)，見表5。

表5 干擾實驗結果

3 討 論

西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀檢測原理為免疫散射比濁法，具有較高的特異性和靈敏度。按照國家醫(yī)學實驗室認可(ISO15189)和CAP(College of American pathology)認可要求，實驗室需對使用的方法進行評價[8]。為證實西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀分析性能的可靠性，筆者參考CLSI文件及資料對此儀器進行初步的分析性能評價。

檢測系統最主要的性能指標是精密度和準確度[9-10]。臨床化學設備或檢測系統精密度的評價通常采用CLIS EP5-A文件，實驗結果顯示，CRP含量在13.84 mg/L和55.6 mg/L時批內不精密度(CV)分別為3.32%和3.58%，總不精密度(CV)分別是4.19%和4.55%，與儀器說明書的精密度性能一致，達到CLIA’88允許誤差的1/3水平(允許不精密度＜8.33%)。準確度驗證實驗通常采用以下三種方法：(1)參考CLSI EP9-A2文件與參考方法或其他比較方法進行比對和偏倚評估。(2)對衛(wèi)生部檢驗中心發(fā)放的室間質控品進行檢測，檢測結果與靶值進行比對。(3)用校準品檢測校準后，在對同一批號和不同批號的校準品檢測，結果與各自的標示值進行比較。本實驗參考CLSI EP15-A，采用不同批號校準品評價儀器的準確度性能，2個批號校準品的驗證值與“靶值”的偏倚在6.06%～6.16%，達到CLIA'88允許誤差的1/2水平(允許誤差＜12.5%)。

羅氏Modular全自動生化分析儀的透射比濁法主要檢測抗原抗體復合物所形成的濁度，西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀的散射比濁法是從不同角度測量抗原抗體復合物微粒的散射光強度和濁度的變化，兩法都屬于免疫比濁法[11]。比對實驗結果顯示在整個分析范圍內，兩種方法測定結果的相對偏差為0.14%～21.21%，且CRP濃度較高時，兩種方法測定結果的相對偏差較小，均少于10%。在兩個醫(yī)學決定水平處，西門子BNⅡ全自動特定蛋白分析儀的散射比濁法與羅氏Modular全自動生化分析儀的透射比濁法檢測結果相當，可以接受。

EP7-A2提供了兩種干擾分析方法：①干擾篩選；②用病人標本評價干擾。本實驗利用Sysmex公司的A-PLUS干擾試劑盒，采用干擾篩選方法評估臨床實驗室的主要干擾(黃疸、溶血和脂血)[12]。實驗結果表明F-Bil 0.2 g/L、C-Bil 0.4 g/L、Hb 4.82 g/L、乳糜835濁度對CRP檢測時干擾無統計學意義。證明該檢測系統檢測CRP的抗黃疸，溶血，脂血的能力較強。

綜上所述，西門子BNII全自動特定蛋白分析儀CRP檢測的主要分析性能符合質量目標要求，可滿足臨床需要。

[1]王 慧,羅 煒,陳 濤.免疫透射比濁法CRP檢測試劑盒的性能評價[J].中國熱帶醫(yī)學,2006,6(8):1479-1480.

[2]徐國賓,蔡 琳.臨床生物化學常規(guī)定量方法的分析性能評價[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2007,30(6):718-720.

[3]李貴星,宋昊嵐.實驗方法的選擇與評價策略[J].四川醫(yī)學,2007,28(3):238-240.

[4]畢 波,呂 元.定量檢測方法學性能驗證的系統設計[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2007,30(2):143-145.

[5]CLSI,EP15-A.User Demonstration of Performance for Precision andAccuracy[S].2004.

[6]CLSI.EP9-A2,Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples[S].2002.

[7]CLSI.EP7-A2.Interference testing in clinical chemistry[S].2005.

[8]U.S.Department of Health and Human Services,Centers for Medicare&Medicaid Services(CMS),Centers for disease control and prevention.Medicare,Medicaid,and CLIA programs;Laboratory requirements relating to quality systems and certain personnel qualifications.Final Rule[S].Federal Register,2003,16:3640-3714.

[9]張秀明,莊俊華,鄭松柏,等.臨床化學發(fā)光免疫法檢測AFP的分析性能驗證與實驗方法[J].中華醫(yī)學檢驗雜志,2007,30(11):1293-1297.

[10]馮仁豐.臨床檢驗質量管理技術基礎[M].2版.上海:上?？茖W技術文獻出版社,2007:85-92.

[11]孫 虹,王 凡,孫 鹥,等.透射和散射比濁法測定血清免疫球蛋白的評價[J].臨床檢驗雜志,2005,23(3):189-191.

[12]徐建華,黃憲章,莊俊華,等.羅氏Modular全自動生化分析儀酶學指標檢測性能驗證[J].檢驗醫(yī)學,2010,25(2):81-85.