蔣玉鳳，羅建明

(1.廣 西 醫(yī) 科 大 學(xué) 研 究 生 院， 廣西 南寧 530021 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021)

遺傳性出凝血紊亂除了凝血因子缺乏外還包括血管性血友病因子(von Willeb rang factor，VWF)質(zhì)或量的異常、血小板膜糖蛋白異常、五因子萊頓(factorV Leiden)突變、ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白 C或S缺乏等參與血液凝集的因素。兒童出凝血功能紊亂主要以先天性或遺傳為主，其根本的發(fā)病機(jī)制就是相關(guān)基因的變異引起相應(yīng)的凝血或抗凝血因子缺乏。近年來有報(bào)道稱在中東部國家及印度南部除了常見的FⅧ、FⅨ缺乏外，F(xiàn)Ⅴ、FⅦ等缺乏也不少見，Pier Mannuccio Mannucci、Stefano Duga等科學(xué)家通過調(diào)查研究意大利及伊郎兩個(gè)國家的1103例隱性遺傳凝集紊亂病人已得到證實(shí)［1］;此外，近年來西方學(xué)者認(rèn)為血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)發(fā)病率已高達(dá)1.3%［2］其發(fā)病率已超過血友病A占據(jù)首位。隨著近年來出凝血分子生物學(xué)的研究表明某些基因變異可導(dǎo)致血管內(nèi)微血栓形成，如五因子萊頓突變(factorV Leiden)、血小板膜糖蛋白 α(GP1Bα)、ADAMTS13缺陷、以及參與凝血的VWF基因突變，如28外顯子A1區(qū)變異所致的2B型VWD［3，4］等。近年來發(fā)現(xiàn)一些不明原因出血以及雖診斷為ITP但經(jīng)ITP治療效果不佳而經(jīng)抗凝治療能取得較好療效的兒科病人在臨床所見不少，在這些病人中是否存在VWF、FⅤ、GPⅠba基因變異而導(dǎo)致出凝血功能紊亂呢?本文就此對2009年3月至2011年1月所收集的不明原因出血及ITP經(jīng)常規(guī)治療不佳而經(jīng)抗凝治療能取得較好療效的門診及住院病人行FV、VWF及GPⅠba基因進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象:收集2009年3月至2011年1月在我院兒科門診及住院部就診的不明原因出血，以及雖然臨床診斷為ITP，按ITP治療無效而經(jīng)抗凝治療能取得較好的效果病例共31例，其中男13例女18例，平均年齡3.8歲。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本采集與DNA提取:收集患兒外周靜脈血ACD抗凝，采用廣州東盛生物科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒按試劑盒提取DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì):采用 Primer及 Oligel軟件對VWF28真基因進(jìn)行特殊引物設(shè)計(jì)［5］，以及對FV10、GPⅠba DNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體引物見表1。

表1 VWF28、GPⅠba、FV10基因特異性引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長度

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)在多通道PCR儀(PTC－220，美國MJ公司)上進(jìn)行，95℃預(yù)變性4min;95℃變性45s;退火溫度見表1，45s;72℃延伸45s;總共32循環(huán)最后延伸10min。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及DNA測序結(jié)果判讀:所有基因擴(kuò)增后均經(jīng)電泳后于凝膠電泳成像分析儀下觀察，呈現(xiàn)清晰、明亮、無拖尾的條帶并以DNA marker為參照，所擴(kuò)增的產(chǎn)物均為所需目的條帶，見圖(1、2)。經(jīng)PCR擴(kuò)增成功的產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并與GenBank中的正常序列進(jìn)行Blast比對;VWF變異位點(diǎn)在國際VWF數(shù)據(jù)庫(http://www.vwf.group.shef.ac.uk/index.html)查詢;GPⅠba及 FV基因變異位點(diǎn)在(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查詢。

圖1 第1、2、3泳道為VWF28、第4泳道及圖2第5泳道為FVF10PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 第1、2、3、4泳道為GPⅠba基因電泳結(jié)果

2 結(jié)果

所有病人VWF28、FV10及GPⅠba基因均成功擴(kuò)增并測序，均未發(fā)現(xiàn)有意義的異常變異，在此實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的基因突變類型經(jīng)證實(shí)均為多態(tài)性位點(diǎn)(見表2)。在此研究中發(fā)現(xiàn)1例病人VWF28存在V1229I變異;1例病人GPⅠba基因存在T119S變異。為了排除多態(tài)性我們用同樣的方法對100例正常人進(jìn)行了等位基因測序分析，發(fā)現(xiàn)各有2、3例正常人存在同樣的突變，由此推測為少見的多態(tài)性位點(diǎn)。

表2 31例患兒VWF28、GPⅠba、FⅤ10基因突變類型頻率

3 討論

在發(fā)展中國家遺傳性出凝血紊亂依然是影響人們生活質(zhì)量的疾病之一，由于經(jīng)濟(jì)文化較落后大部分病人都得不到有效的診斷與治療，甚至導(dǎo)致殘疾。生活質(zhì)量嚴(yán)重降低，為家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。我國有關(guān)學(xué)者統(tǒng)計(jì)1983年至2002年在北京大學(xué)就診的1312例出血凝集紊亂病人，其中血友病占89.8%、血管性血友病占5.1%、診斷不明確的凝集紊亂占1.7%。且大部病人出現(xiàn)出血癥狀的中位年齡都在嬰幼兒時(shí)期，遺憾的是大部病人確診的中位年齡都在10歲以后［6］。從本研究所收集的病例中出現(xiàn)癥狀的患兒平均年齡3.8歲，最小2月，與文獻(xiàn)［4］所報(bào)道的初次發(fā)病的年齡相仿。本研究還發(fā)現(xiàn)很大部分病人在出現(xiàn)較嚴(yán)重的癥狀前已有鼻出血或皮膚粘膜易出現(xiàn)瘀斑、瘀點(diǎn)現(xiàn)象，而往往在感冒發(fā)熱后病情加重而入院，這可能與外環(huán)境因素打破了出凝血平衡有關(guān)。值得提出的是由于大部病人在出現(xiàn)較嚴(yán)重的出血癥狀而就診，而一些只有輕型出血的病人往往被家長及醫(yī)生疏乎而漏診，比如I型VWD占所有VWD的75%且絕大部分只有輕至中度的皮膚粘膜出血［7］。我國相關(guān)學(xué)者2003年在國際上所發(fā)表的論文［6］所統(tǒng)計(jì)的VWD僅占出血凝集紊亂的1.7%，遠(yuǎn)少于血友病89.8%的發(fā)病率，這與如今西方大部分學(xué)者已認(rèn)為VWD是最常見的遺傳性出血性疾病且發(fā)病率已超過血友病A而居首位［2］完全不同。這可能與我國經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療水平較落后有關(guān)。從本文研究結(jié)果中得出，31例病人中未被檢出VWF基因變異，這可能與收集的標(biāo)本量太少或只是對VWF28外顯子擴(kuò)增，由此對于一些在VWF基因全長均可發(fā)生變異的VWD漏診，鑒于近年來西方學(xué)者對VWD的大量報(bào)道，值得我們對其進(jìn)行學(xué)習(xí)及研究。

VWF是一種大分子糖蛋白，最先發(fā)現(xiàn)的變異在VWF基因28外顯子上，72%的變異位點(diǎn)都可在28外顯子上找到(http://mmg2.im.med.umich.edu vWF)。在本研究中就此僅對VWF基因第28外顯子擴(kuò)增測序，發(fā)現(xiàn)1例病人存在V1229I變異，經(jīng)查閱VWF國際數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在1998年及2007年分別在意大利、加拿大發(fā)現(xiàn)此同樣位點(diǎn)V1229G變異而導(dǎo)致1型VWD。經(jīng)過對照研究，結(jié)果得出此位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)，其發(fā)生率為2%。此外在VWF28外顯子發(fā)現(xiàn)的T1381A、D1472H、V1565L三個(gè)位點(diǎn)的突變均為多態(tài)性位點(diǎn)其發(fā)生頻率與國際VWF數(shù)據(jù)庫登記的頻率相仿。

初期止血的基本過程為當(dāng)血管壁破損后血小板在大分子糖蛋白VWF因子幫助下其A1區(qū)與血小板GPⅠb受體結(jié)合完成初期止血功能，如血小板膜糖蛋白GPⅠb異常則會(huì)導(dǎo)致血小板粘附功能異常而出血。最常見的血小板型血管性血友病以GPⅠba基因突變?yōu)樘攸c(diǎn)［8］。在本研究中54.8%的病人為診斷ITP但經(jīng)ITP治療無效而適當(dāng)口服抗凝藥卻能取得較好的療效，為此對本研究所收集的患兒都進(jìn)行了有可能導(dǎo)致血管內(nèi)微血栓形成的常見因子如VWF、GPⅠba、Fⅴ、進(jìn)行基因研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常突變，這有可能與所收集的病例數(shù)不夠或本身VWF、GPⅠBA、FⅤ基因發(fā)生異常變異機(jī)率非常小有關(guān)［9］。除此之外，ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白C、蛋白S缺陷也成為血管內(nèi)微血栓形成的因素［10］，但由于基金原因未對上述基因進(jìn)行研究有待以后相關(guān)學(xué)者對此展開更深入的研究。

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