孫筱茹，張雅楠，陳一辰，齊 飛，羅 政，李茹男，郭連英，郝 冰，施廣霞

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 2007級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學(xué) 病理生理教研室，遼寧 大連 116044)

核因子κB(nuclear factorκB， NF-κB)，是1986年Sen和Baltimore首先發(fā)現(xiàn)并對其進行了描述，因其能與B細胞免疫球蛋白上的輕鏈基因增強子κB序列(GGGACT1TCC)特異結(jié)合而得名[1]。NF-κB近年來越來越受到人們的關(guān)注，它不僅通過調(diào)控細胞因子等的表達參與各種免疫、炎癥、應(yīng)激性反應(yīng)，還是細胞內(nèi)重要的抗凋亡、促增殖的信號，NF-κB的組成性表達和異?；罨悄[瘤化療耐藥的重要機制[2]， NF-κB抑制劑的抗腫瘤作用近年來已開始受到人們的重視并開發(fā)出多種小分子制劑[3]，吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是研究應(yīng)用較多的一種。順鉑是常用的抗腫瘤藥物，用于治療肺癌、肝癌和卵巢癌等多種常見惡性腫瘤，但順鉑的全身毒性是不可忽視的，尤其是腎毒性和對造血功能的影響，臨床順鉑化療腎損害發(fā)生率為25%～35%[4]。本實驗使用NF-κB抑制劑PDTC與順鉑合用，觀察其對順鉑毒性作用的影響，以探討NF-κB在順鉑所致毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠60只(體重210～250 g)，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器：PDTC(25 mg/kg)、順鉑(10 mg /2 mL)(由山東多欣藥業(yè)有限公司提供)、0.9%生理鹽水、一氧化氮試劑盒、碘[125I]白細胞介素1放射免疫分析藥盒、碘[125I]腫瘤壞死因子-α放射免疫分析藥盒(均由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供)考馬斯亮藍、乙醇、96孔板、721分光光度計、勻漿器、離心機、水浴槽。

1.2 方 法

1.2.1 實驗分組及用藥：先取20只SD大鼠分別腹腔注射順鉑和順鉑+PDTC，觀察動物至死亡，以確定用藥劑量和動物模型終止時間。再取40只SD大鼠隨機分為4組，分別是空白對照組，PDTC組，順鉑組，PDTC及順鉑聯(lián)合用藥組，每組10只。腹腔注射，空白對照組(生理鹽水0.2 mL/d)，PDTC組(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，生理鹽水0.1 mL/d)，順鉑組(順鉑10 mg /2 mL 、0.1 mL/d，生理鹽水0.1 mL/d)，PDTC及順鉑聯(lián)合用藥組(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，順鉑10 mg /2 mL,0.1 mL/d)。

1.2.2 標本及指標的采集：對照組和PDTC組于實驗第13天、順鉑組和順鉑+PDTC組于用藥后第4天經(jīng)大鼠尾取血，做白細胞計數(shù)。次日處死所有大鼠，大鼠內(nèi)眥取血做血涂片、白細胞計數(shù)和分離血清，稱體重和腎重。取腎組織加入生理鹽水制備腎組織勻漿。

1.2.3 采用放射免疫分析測血清和腎組織勻漿中細胞因子TNF-α和IL-1的量，用生物化學(xué)方法測血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 腎系數(shù)(腎/體)各組間比較

實驗結(jié)果表明順鉑對大鼠有較大毒性，預(yù)實驗中10只大鼠于9 d內(nèi)全部死亡，合用PDTC未延長大鼠的壽命，必須縮短觀察時間實驗才能進行。4組中應(yīng)用順鉑的大鼠腎系數(shù)增高，為4.9440±0.5456，與對照組比較差異具有顯著性意義，P<0.05，PDTC組與對照組、PDTC聯(lián)合順鉑組與單用順鉑組比較腎系數(shù)的差異無顯著性意義，P>0.05。見表1。

表1 用藥后腎系數(shù)的變化

1)與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05

2.2 各組間外周血白細胞計數(shù)比較

注射順鉑的小鼠外周血白細胞數(shù)目降低至(3780±1760.713)個/mm3，與對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)，合用PDTC組外周血白細胞數(shù)略有增加，但與順鉑組比較差異無顯著性意義(P>0.05),見表2。

表2 用藥后外周血白細胞計數(shù)變化

1)與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05

2.3 大鼠血清和腎組織勻漿TNF-α、IL-1含量的變化

注射順鉑大鼠TNF-α順鉑組血清中TNF-α的含量低于對照組,應(yīng)用順鉑后大鼠血清IL-1水平?jīng)]有明顯變化，腎組織勻漿IL-1含量明顯增加。聯(lián)合應(yīng)用PDTC 后含量下降，與單用順鉑組比較差異具有顯著性意義(P<0.05)。

表3 用藥后大鼠血清和腎組織勻漿TNF-α、IL-1含量的變化

1) 與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05；3)與順鉑組比較，P<0.05

2.4 大鼠血清BUN、Cr含量

單用順鉑或合用PDTC的大鼠血清BUN及Cr較對照組均有明顯升高(P<0.05)，而兩組之間的差異無顯著性意義。見表4。

表4 大鼠血清BUN和Cr含量的變化

1)與對照組比較,P<0.05

3 討 論

PDTC有清除氧自由基的作用，Rangan等[5]最早應(yīng)用于體內(nèi)抑制大鼠腎小管內(nèi)皮細胞NF-κB的激活，劑量達200 mg/kg，未發(fā)現(xiàn)明確的毒性作用。選擇抗氧化劑PDTC來抑制NF-κB的激活是依據(jù)：(1)許多已知的IκBα磷酸化誘導(dǎo)物可使活性氧產(chǎn)生增加。NF-κB抑制蛋白-IκBα的降解又是NF-κB活化的中心環(huán)節(jié)。(2) H2O2：可激活某些細胞中的NF-κB,活性氧是順鉑引起腎毒性的重要機制[6]。(3)TNF-α誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可以產(chǎn)生活性氧介質(zhì)(ROS)。PDTC對甘油所致腎損傷有保護作用[7]。本實驗結(jié)果表明順鉑對大鼠有很強的毒性，出現(xiàn)體重降低、腎臟腫大和血清BUN與Cr含量增高、外周血白細胞數(shù)目減少等。PDTC 本身不引起上述毒性反應(yīng)，但本實驗條件下合用PDTC不能減輕上述毒性反應(yīng)。

順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡與死亡受體及配體有關(guān),順鉑處理的大鼠腎小管上皮細胞Fas、Fas-L、TNF-α mRNA表達顯著增高[8]?，F(xiàn)已有人觀察到順鉑腎損害過程中大量的炎性細胞因子、趨化因子的活化,并認為TNF-α可能是中心啟動環(huán)節(jié)。PDTC抑制NF-κB傳導(dǎo)通路的活化，即抑制了TNF-α基因位點的轉(zhuǎn)錄活性，減少致炎因子的基因表達與合成釋放,減少TNF-α的表達[7]。應(yīng)用PDTC的正常大鼠腎組織勻漿中TNF-α含量降低。但與順鉑聯(lián)合用藥后不能降低腎組織勻漿TNF-α含量，順鉑處理的大鼠腎組織勻漿IL-1含量明顯升高，聯(lián)合PDTC可降低其含量。本實驗的結(jié)果說明PDTC本身無明顯毒性，能降低順鉑處理的大鼠腎組織勻漿中IL-1的含量，這些變化在順鉑腎毒性產(chǎn)生的機制與防治中的意義還有待進一步研究。

[1] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequence[J].Cell,1986,46 (5):705-716.

[2] Saxaki N,Morisaki T,Hashizume K.Nuclear factor-κB p65 (RelA) transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J].Clin Cancer Res,2001,7(12):4136-4142.

[3] Gupta S,Sundaram C,Reuter S.Inhibiting NF-κB activation by small molecules as a therapeutic strategy[J].BBA-Gene Regul Mech,2010,1799: 775-787.

[4] Ramesh G,Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-α[J].Kidney Int,2004,65(2): 490-498.

[5] Rangan GK,Wang Y,Tay YC,et al．Inhibition of nuclear factor-κB activation reduces cortical tubulointerstitial injury in protein uric rats[J]．Kidney Int，1999,56(1)：118-134.

[6] Rasoulian B,Jafari M,Mahbod M,et al.Pretreatment with oxygen protects rat kidney from cisplatin nephrotoxicity[J].Ren Fail,2010,32(2):234-242.

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