張 璇，樸豐源，劉 鵬

(大連醫(yī)科大學(xué) 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

砷(As)是自然界存在的有毒類金屬元素，廣泛分布于巖石、土壤和水環(huán)境中[1]。人體暴露主要經(jīng)呼吸道和消化道途徑進入機體，長期攝入會在體內(nèi)蓄積，引起慢性砷中毒。由于神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)細胞不能再生及對毒物的毒性作用較其他組織系統(tǒng)更為敏感的特殊性,使之在砷中毒的研究中顯得尤為重要。人群流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗均顯示，砷可引起認知障礙、智力低下等神經(jīng)行為異常[2]，但其神經(jīng)毒作用機制尚不清楚。學(xué)習(xí)記憶是腦的高級功能之一，是衡量動物智力發(fā)育的重要指標(biāo)，是通過神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的神經(jīng)化學(xué)傳遞等一系列生理生化過程實現(xiàn)的。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)對注意力、記憶力和反應(yīng)能力有著重要的調(diào)節(jié)作用，主要包括多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE) 和5-羥色胺(5-HT)等。任何有害因素使神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)這些神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和轉(zhuǎn)運減少，都會影響神經(jīng)遞質(zhì)在突觸的正常傳遞，導(dǎo)致學(xué)習(xí)功能損傷[3]。

關(guān)于砷暴露對動物腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度影響的文獻報道不多，尤其對低劑量染砷的影響研究更為少見。因此，本文針對亞慢性低劑量暴露條件下，砷對小鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的影響以及?；撬岷途S生素C對砷中毒時腦的保護作用進行了觀察，以期為砷的神經(jīng)毒作用機制研究提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

As2O3(sigma,美國)；?；撬?St.Louis,美國)；維生素C(St.Louis,美國)； 5-羥色胺(5-HT)(sigma,美國)； 多巴胺(DA) (sigma,美國)；去甲腎上腺素(NE)(sigma,美國)；色譜級甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國)；乙酸鈉(上?；瘜W(xué)試劑有限公司，中國)； 高氯酸(天津市鑫源化工有限公司，中國)。實驗用水為雙蒸水。

1.2 主要儀器

高效液相色譜(1525)-熒光檢測器(waters 474)(waters 公司，美國)；HC-2518R 高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，中國)；玻璃勻漿器；Milli-Q超純水系統(tǒng); Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所DMS-2)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

SPF級小鼠70只，雌雄各半，體重(20±2) g，購于大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。按體重將小鼠隨機分為6組，即飲用水對照組、1 ppm As2O3染砷組、2 ppm As2O3染砷組、4 ppm As2O3染砷組、兩個保護組(4 ppm As2O3+ 150 mg/kg?；撬醄4]和4 ppm As2O3+45 mg/kg維生素C[5])。除高劑量染砷組(4 ppm As2O3染砷組)20只外，其余每組10只小鼠。小鼠通過自然飲用含不同濃度As2O3蒸餾水方式暴露于砷，保護劑是以灌胃方式給予，每星期2次。高劑量染砷組分別染毒第30和60天，其余組均在第60天斷頭處死小鼠，取腦組織，-80 ℃凍存。

1.3.2 腦勻漿的制備

頸椎脫臼法處死小鼠，取腦組織，置于-80 ℃冷凍存放。取冰凍腦組織稱重，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入0.1 mol/L的高氯酸上下轉(zhuǎn)動數(shù)十次，充分研磨使組織勻漿化。將勻漿液轉(zhuǎn)入Ependorf離心管中，4 ℃低溫離心(10000 r/min，10 min)，重復(fù)2次，收集上清液，用微孔過濾器過濾，得到待測樣品溶液。

1.3.3 Morris水迷宮行為測定

Morris水迷宮[6]實驗是一種強迫實驗動物游泳、學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力。每次實驗以120 s為限，記錄動物在120 s內(nèi)尋找到平臺的時間(稱逃避潛伏期)。以所需時間作為學(xué)習(xí)和記憶成績，若設(shè)定時間內(nèi)未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120 s。本實驗中，設(shè)立對照組、1 ppm As2O3和4 ppm As2O3染毒組，每組10只小鼠，雌雄各半。

1.3.4 高效液相色譜-熒光檢測法測定腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化

儀器：Waters 1525高效液相色譜儀，配備Waters 474熒光檢測器。分析柱為C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm)。流動相：A=甲醇、 B=0.1 mol/L醋酸鈉(內(nèi)含0.1 mol/L EDTA-2Na)緩沖液(用濃鹽酸調(diào)pH為5.0，經(jīng)0.45 μm的微膜過濾并超聲脫氣后使用)，A∶B=1∶9，流速1.0 mL/min。進樣體積為20 μL，柱溫為室溫(25 ℃)。熒光檢測器波長設(shè)置：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長315 nm，采用外標(biāo)法定量。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：稱取標(biāo)準(zhǔn)品NE 4.23 mg、DA 47.40 mg、5-HT 5.318 mg，分別溶于0.1 mol/L HCl中，并定容于50 mL容量瓶，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(NE 2.5 mmol /L，DA 5 mmol/L，5-HT 0.5 mmol/L),4 ℃保存，再按需要用0.1 mol/L HCl稀釋成各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:NE在1.0～300 ng/g之間、DA為1.0～250 ng/g之間、5-HT為1.0～200 ng/g之間設(shè)定3個濃度系列，取20 μL進樣，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)混合液標(biāo)準(zhǔn)測定色譜圖:如圖1所示。在本實驗條件下，NE、DA、5-HT 3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品能夠很好的分離。

圖1 3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)混合液標(biāo)準(zhǔn)測定色譜圖(ng/g)

小鼠腦勻漿中各物質(zhì)測定色譜圖:如圖2所示。在本次實驗的色譜條件下，NE、DA、5-HT 3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)得到了良好的分離，其他雜質(zhì)對測定結(jié)果幾乎沒有干擾。

樣品測定:處理后的樣品直接進樣，以保留時間定性，外標(biāo)法定量。

圖2 小鼠腦勻漿中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定色譜圖(ng/g)

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 砷對小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

Morris 水迷宮結(jié)果顯示，As2O3染毒60 d后，4 ppm As2O3染毒組小鼠的逃避潛伏期比對照組長 (P<0.05)，并且逃避潛伏期隨著染毒劑量的增加而增長(圖3A)。此外，圖3B顯示，對照組小鼠的逃避潛伏期在60 d內(nèi)，逐漸呈縮短趨勢，而4 ppm As2O3染砷組小鼠的逃避潛伏期從染毒30 d后逐漸增加，與對照組比較差異有顯著性意義 (P<0.05)。

圖3 Morris水迷宮測定As2O3對小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

2.2 亞慢性砷暴露小鼠大腦NE、DA和5-HT濃度的變化

如表1所示，與對照組比較，染砷60 d后，染砷組小鼠大腦中5-HT、DA和NE濃度明顯減少，差異有顯著性意義 (P<0.05)，但1 ppm染毒組NE濃度與對照組比較差異無顯著性意義；與1 ppm染砷組比較，2 ppm和4 ppm染毒組NE濃度明顯減少，差異有顯著性意義 (P<0.05)；DA含量隨染毒劑量的增加逐漸降低，差異有顯著性意義(P<0.05)。

表1 亞慢性砷暴露小鼠大腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量

NE：去甲腎上腺素，DA：多巴胺，5-HT： 5-羥色胺。1) 與對照組比，P<0.05； 2) 與1 ppm染砷組比，P<0.05； 3) 與2 ppm染砷組比，P<0.05

2.3 染砷組小鼠大腦中NE、DA和5-HT濃度隨時間變化差異

如圖4所示，隨染砷時間增加，4 ppm組小鼠大腦中NE、DA和5-HT濃度逐漸減少，與染砷第0天比較差異有顯著性意義(P<0.05)；5-HT在染砷30 d下降趨勢較大，但在染砷第30天和第60天比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

2.4 ?；撬岷途S生素C保護組對小鼠大腦NE、DA和5-HT的影響

如表2所示，與對照組比較，高劑量染砷組小鼠大腦中5-HT、DA和NE濃度明顯降低，且差異有顯著性意義(P<0.05)；與4 ppm染砷組比，維生素C組和?；撬峤M小鼠大腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度明顯升高，除了5-HT在牛磺酸組差異無顯著性意義外，其余均差異有顯著性意義(P<0.05)。

圖4 4 ppm染砷組小鼠大腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度隨時間變化

表2 ?；撬岷途S生素C對砷暴露小鼠大腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的保護作用

NE：去甲腎上腺素，DA：多巴胺，5-HT：5-羥色胺。1) 與對照組比，P<0.05；2) 與4 ppm組比，P<0.05

3 討 論

砷是一種公認的神經(jīng)毒物。據(jù)文獻報道，職業(yè)砷接觸可引起成人學(xué)習(xí)和記憶能力的損害，環(huán)境砷暴露可影響兒童的語言能力和長期記憶[7,8]。Morris水迷宮結(jié)果顯示，砷暴露組小鼠的逃避潛伏期明顯比對照組長(P<0.05)，隨著砷暴露時間的延長，砷暴露小鼠的逃避潛伏期增加，與Miyagawa等[9]的研究結(jié)果一致。提示砷暴露可能嚴重影響小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。但目前其神經(jīng)毒作用機制并不十分清楚。Tripathi等[10]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予100 ppm砷后大鼠腦內(nèi)的多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)的濃度下降。Delqado[11]也報道，當(dāng)砷暴露劑量在20～100 ppm時，影響腦中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。這些文獻結(jié)果提示，神經(jīng)遞質(zhì)很可能是砷的神經(jīng)毒作用的靶部位。

本次實驗的目的是觀察亞慢性低劑量砷暴露對小鼠腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。與對照組比較，各染砷組小鼠腦中5-HT、DA和NE濃度均有顯著性降低(P<0.05)。除5-HT濃度外，其他2種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)隨著染毒劑量的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。而且，隨著染毒天數(shù)的增加，高劑量染砷組小鼠腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)均顯著降低。本研究結(jié)果表明，在接近環(huán)境中實際暴露劑量的亞慢性染砷也能夠降低小鼠腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平。一些研究結(jié)果顯示，NE減少可導(dǎo)致抑郁、癡呆和注意力低下。多巴胺能神經(jīng)元起源于紋狀體而投射到中腦皮質(zhì)和邊緣葉，而這兩部分恰恰構(gòu)成了行為學(xué)習(xí)通路，所以多巴胺能活性跟學(xué)習(xí)行為激發(fā)有很大關(guān)聯(lián)[12]。大多數(shù)的5-HT分布在丘腦、下丘腦、中腦以及腦干的脊核中[13]，證明5-HT系統(tǒng)對于調(diào)整記憶系統(tǒng)的重要性[14]。本研究結(jié)果和文獻提示，亞慢性砷暴露對小鼠腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度影響可能與染砷小鼠學(xué)習(xí)和記憶力低下有關(guān)。

?；撬崾侨梭w內(nèi)含量較高的游離氨基酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要生理功能，是一種有抑制性作用的氨基酸，具有廣泛的細胞保護作用[15]。維生素C是人體必需的營養(yǎng)素,參與許多重要的生理功能,如維持細胞正常能量代謝、消除自由基等。本實驗結(jié)果表明,與4 ppm染砷組小鼠比較，添加?；撬岷途S生素C的小鼠腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平都有不同程度的增高，對砷的毒性具有一定的拮抗作用。這些結(jié)果說明，?；撬岷途S生素C對砷所產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)有害影響具有一定的保護作用。

綜上所述，亞慢性低劑量的砷暴露能夠降低小鼠腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，并且?；撬岷途S生素C對砷導(dǎo)致NE、DA、5-HT水平降低有一定的拮抗作用。今后，進一步深入研究亞慢性砷暴露致腦中3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少的分子機制以及與染砷小鼠學(xué)習(xí)、記憶力低下之間的內(nèi)在聯(lián)系是十分必要的。

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