柴永川 綜述 楊濤 吳皓 審校

研究表明，大前庭水管綜合征(enlargement of vestibular aqueduct,EVA)和Pendred綜合征(pendrend syndrome,PS)的發(fā)病與SLC26A4基因密切相關(guān)。 SLC26A4基因最先由Everett等[1]在一個PS家系中定位克隆，并被命名為PDS基因。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因突變也可引起非綜合征型聾(DFNB4)[2]。由于PDS基因與溶質(zhì)蛋白家族SLC26其他成員的結(jié)構(gòu)和功能類似，故PDS基因又重新命名為SLC26A4基因(solute carrier family 26,member 4,SLC26A4)?，F(xiàn)在認為EVA/PS是與SLC26A4有關(guān)的同一種遺傳病的兩種不同的疾病表現(xiàn)[3]。

1 SLC26A4基因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

2 SLC26A4基因的篩查研究

2.1SLC26A4基因突變譜及突變類型 對EVA/PS患者SLC26A4基因的篩查研究已廣泛開展。SLC26A4基因突變譜很廣，截止到2010年1月，已有超過170種突變被報道(www.healthcare.uiowa.edu/labs/pendredandbor)，除分布于SLC26A4的編碼區(qū)和剪接位點外，位于非編碼區(qū)外顯子1，結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXI1的啟動子序列中也發(fā)現(xiàn)有突變[8]。SLC26A4基因突變所導(dǎo)致的蛋白質(zhì)改變可遍及整個蛋白質(zhì)長度，在其跨膜結(jié)構(gòu)的膜內(nèi)段及膜外段都有不均等的分布。突變類型也多種多樣，包括移碼突變、錯義突變、無義突變以及剪接位點突變等。

2.2SLC26A4基因的突變熱點 SLC26A4基因存在著熱點突變，但表現(xiàn)出明顯的地域和種族差異性。王秋菊等[9]于2007年通過對我國107個EVA耳聾家系及相應(yīng)對照人群的研究分析，揭示出中國EVA耳聾患者所特有的SLC26A4基因突變譜，其研究顯示高達97.9%的患者至少攜帶一個SLC26A4突變，并且88.4%的患者是雙等位基因突變，這些患者共出現(xiàn)了40種突變，包括25種新的突變，其中c.919-2A>G突變是中國人群中最常見的突變方式，占總突變數(shù)的57.63%，其次是p.H723R，占9.04%，而且在Exon7、8、10、19、15以及17中的突變之和占了總突變數(shù)的84.2%。這一特點對于臨床實踐具有重要的提示作用，即對于EVA/PS患者，只要進行SLC26A4基因的突變熱點檢測，就可以對大部分患者作出明確的分子診斷，極大的提高了基因篩查的效率。2008年戴樸等[10]針對中國人群SLC26A4基因高發(fā)突變c.919-2A>G在我國27個地區(qū)3 271名中重度感音神經(jīng)性聾患者中進行了篩查，詳細闡述了此突變在我國各民族地區(qū)的分布及其代表性和特異性。2009年戴樸等[11]利用變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)和直接DNA測序的方法，對中國和美國EVS/PS患者進行SLC26A4基因檢測，揭示了中美患者不同的SLC26A4突變譜，并顯示出兩國EVA耳聾患者SLC26A4基因突變的高診斷檢出率，該研究顯示：在55例中國EVA耳聾患者中，有52例(95%)患者SLC26A4基因檢測出突變，其中36例(76%)患者具有雙等位基因突變，并且在SLC26A4基因突變圖譜中c.919-2A>G(73%)和 p.H723R(14%)占了總突變的87%；與中國人群相比，美國患者中SLC26A4基因突變檢出率相對較低，為20%(50患者中檢出10例突變：3例為雙等位基因突變，7例為單等位基因突變)，并且p.L236P和p.T416P等是該人群中最常見的突變類型。

在東亞的蒙古人種中，日本和韓國SLC26A4基因的主要突變方式為p.H723R。在日本p.H723R占SLC26A4突變的53%，而與日本有所不同的是韓國c.919-2A>G突變也比較普遍[12, 13]。在歐美的高加索人種中，最常見的三個突變是p.L236P(16%)、p.T416P(15%)和IVS8+1G>A(14%)，這三者突變之和約占總突變數(shù)一半，而在東亞人群中這三種突變方式很少見[14]。

2.3SLC26A4非雙等位基因突變 在EVA/PS患者中，SLC26A4基因存在著大量的非雙等位基因突變，而且在不同國家中非等位基因突變的比例存在差異。據(jù)不同文獻報道，北美和歐洲的比例最高，占EVA患者總數(shù)的67%～85%[8, 15～17]；東亞的日本和韓國分別為53%和19%[12, 13]；我國為11.6%左右[9]。在一些無SLC26A4雙等位基因突變的EVA耳聾的小型家系中，通過單倍體型分析發(fā)現(xiàn)：子代中SLC26A4基因型相同的兄弟姐妹，有的具有EVA表型，有的則完全正常，并且在一對SLC26A4等位基因完全相同但EVA表型卻完全不同的姐妹中，發(fā)現(xiàn)有其他相關(guān)基因的區(qū)別，這些與單基因常染色體隱性遺傳方式不符[8, 18]。上述事實表明除SLC26A4基因外，還存在著其他基因和/或環(huán)境因素參與了EVA/PS病因的構(gòu)成。

3 SLC26A4基因的功能研究

3.1SLC26A4基因正常功能的研究 SLC26A4表達于甲狀腺、腎臟及內(nèi)耳。和其離子轉(zhuǎn)運功能相對應(yīng)，Pendrin在內(nèi)耳中表達于內(nèi)淋巴管、內(nèi)淋巴囊、橢圓囊、球囊、血管紋紡錘形細胞、耳蝸外溝和螺旋突起[19, 20]，這些部位都與維持內(nèi)淋巴液離子環(huán)境的動態(tài)平衡有著密切聯(lián)系。因此推測SLC26A4基因的突變可能導(dǎo)致內(nèi)淋巴液離子環(huán)境失衡，進而導(dǎo)致耳聾，這一點已經(jīng)在近期研究中通過對EVA動物模型SLC26A4基因敲除小鼠的內(nèi)淋巴液離子成分分析被初步證實[21]。但是有關(guān)SLC26A4基因突變致聾的具體分子機制目前尚不清楚。在甲狀腺中，SLC26A4基因表達于甲狀腺濾泡細胞的頂端膜上，該處Pendrin的功能與Cl-/I-的轉(zhuǎn)運有關(guān)[6]。具體機制是甲狀腺濾泡細胞基底膜上有Na+-I-同向轉(zhuǎn)運體(sodium iodide symporter, NIS)表達，通過其轉(zhuǎn)運作用I-從血液循環(huán)中被轉(zhuǎn)運到甲狀腺濾泡細胞中，然后經(jīng)位于甲狀腺濾泡上皮頂膜上的Pendrin轉(zhuǎn)運到膠質(zhì)中儲存。這種有效的I-的捕獲機制促使位于甲狀腺球蛋白絡(luò)氨酸殘基上的碘離子氧化和有機化，從而經(jīng)酶耦合形成甲狀腺激素。相關(guān)研究[6, 22]推測：SLC26A4基因突變使得Pendrin失去Cl-/I-的離子轉(zhuǎn)運功能是導(dǎo)致并發(fā)性甲狀腺腫的原因，從而表現(xiàn)為Pendred綜合癥。但是臨床同時發(fā)現(xiàn)，相同突變類型在不同的個體中其甲狀腺表型變化極大，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有待于深入研究。

3.2SLC26A4基因異常功能的研究 在SLC26A4基因的突變類型中，移碼突變、無義突變及剪接位點突變的致病性是公認的。對于單個氨基酸改變的錯義突變，若符合以下兩個原則則普遍被認為具有高致病性可能：①與不同物種的基因序列相比較，證實被替代的氨基酸是高度保守的；②正常對照人群中相對應(yīng)的錯義突變發(fā)生率極低。然而這些標(biāo)準(zhǔn)只能提供突變致病性的間接證據(jù)，對于一些罕見的基因型多態(tài)并不能做出有效的推測，而且個別功能性致病突變也可能發(fā)生在非保守氨基酸上，因此在這種情況下要明確突變?nèi)绾斡绊懟虻墓δ苤荒芙柚诠δ苎芯俊?/p>

3.2.1SLC26A4基因突變致Pendrin蛋白定位異常 Rotman-Pikielny等[23]在活體細胞中利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記野生型(wild-type,WT)及三種高加索人群中最常見的突變型Pendrin蛋白(p.L236P、P.T416P、p.G384E)在細胞內(nèi)的運輸，共定位研究顯示GFP-WT Pendrin能正確定位到細胞膜上，而三種Pendrin突變體都滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。和隱性遺傳模式相對應(yīng)，突變Pendrin不會抑制野生型Pendrin或者其他膜蛋白(如病毒膜蛋白VSVGtsO45)到細胞膜上的運輸，從而可以解釋攜帶有單個致病性突變的個體不會出現(xiàn)相關(guān)表型的原因。同年Taylor等[22]研究了9個錯義突變的Pendrin突變體在細胞上的定位，不僅發(fā)現(xiàn)有完全滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的突變體，而且發(fā)現(xiàn)有部分滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、部分定位到細胞膜以及完全正確定位到細胞膜上的突變體。對于突變體蛋白為什么不能運輸?shù)郊毎ど希话阏J為是突變引起了肽鏈的異常折疊，從而干擾了蛋白質(zhì)的成熟及其到細胞膜上的運輸，這種突變機制在很多跨膜轉(zhuǎn)運蛋白中都有報道，而且這種突變都是致病性的[24]。對于滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Pendrin突變體在EVA/PS疾病中的致病性容易理解，但對于能正常定位到細胞膜或部分定位到細胞膜的Pendrin突變體的致病性則需進一步的研究。

3.2.2突變致Pendrin蛋白介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運異常 突變體蛋白正常運輸?shù)郊毎ど虾?，其離子轉(zhuǎn)運功能障礙也會引起疾病的發(fā)生。Taylor等[22]研究了Pendrin突變體在細胞中轉(zhuǎn)運碘離子的功能，結(jié)果顯示相當(dāng)量的突變體與野生型的Pendrin存在著明顯的差異。他們首先使細胞轉(zhuǎn)染Na+/I-離子同向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(NIS)，這樣NIS便可以從細胞外吸收足夠的I-，從而通過I-的外流實驗分析這些突變體對I-轉(zhuǎn)運功能的影響。結(jié)果顯示，僅轉(zhuǎn)染NIS的細胞I-的流出率很低，而共轉(zhuǎn)染了NIS和野生型SLC26A4的細胞在1分鐘時測量的I-流出率顯著提高。在共轉(zhuǎn)染了NIS和能正常定位到細胞膜上的Pendrin突變體(p.L117F,p.G209V)以及部分能定位到細胞膜上的Pendrin突變體(p.Y556C,p.G672E)的細胞中，只有p.L117F的細胞I-流出率與野生型相似，p.G209V有部分I-的流出功能，但是其流出率明顯降低，其余突變體的功能則與共轉(zhuǎn)染了NIS和完全不能定位到細胞膜的突變體(p.G102R、p.V138F、p.L236P、p.T410M、p.Q446R)的細胞一樣，完全喪失了I-的流出能力。這一結(jié)論表明，定位異常的Pendrin可完全喪失I-的轉(zhuǎn)運能力，即使能正常定位到細胞膜的Pendrin突變體其轉(zhuǎn)運I-的能力也可能有所下降，從而具有致病性。

2008年P(guān)era等[25]通過功能實驗得出結(jié)論，用于預(yù)測SLC26A4錯義突變后離子轉(zhuǎn)運功能降低的兩個標(biāo)準(zhǔn)：①突變在對照人群中的低發(fā)生率；②突變導(dǎo)致了保守氨基酸的替代—有時是不可靠的。有些符合上述兩個標(biāo)準(zhǔn)的突變其離子轉(zhuǎn)運功能正常，而在正常對照人群中發(fā)現(xiàn)的某些被認為是多態(tài)的基因改變，其離子轉(zhuǎn)運功能卻明顯降低。同時通過10個錯義突變的功能試驗一致性證實：在蛋白質(zhì)水平上脯氨酸或者帶電氨基酸的增減對Pendrin的功能是有害的，其一個有力證據(jù)[25]是p.V88I和p. L597 S突變后Pendrin突變體的離子轉(zhuǎn)運功能正常，但當(dāng)p.V88I和p. L597S變成p.V88P和p. L597P后Pendrin的離子轉(zhuǎn)運功能則完全損失。這一結(jié)論對于預(yù)測突變的致病性有重要的幫助。但需要著重指出的是，當(dāng)錯義突變沒有增減帶電氨基酸或者脯氨酸時，這種改變在功能上既可能是有害的也可能是無害的，若要明確其致病性則需要功能驗證。

4 SLC26A4基因與其他基因之間的聯(lián)系

4.1SLC26A4與FOXI1基因 2007年由Yang等[8]首先在EVA/PS患者中證實了SLC26A4與FOXI1基因之間的致病相關(guān)性，他們在372例SLC26A4無雙等位基因突變的EVA/PS患者中發(fā)現(xiàn)6例患者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因FOXI1中具有突變，9例患者在SLC26A4基因的啟動子中具有c.-103T>C突變，其中有一例患者的突變類型是雙基因的復(fù)合雜合突變，即分別攜帶有SLC26A4和FOXI1單個等位基因突變；通過對啟動子中c.-103T>C的突變以及FOXI1基因本身突變的功能研究證實，F(xiàn)OXI1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因與SLC26A4的啟動子結(jié)合后，對SLC26A4的轉(zhuǎn)錄具有激活作用。當(dāng)SLC26A4轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因FOXI1或啟動子的突變聯(lián)合SLC26A4的致病突變時，將引起EVA/PS疾病的發(fā)生，這種雙基因的遺傳模式在基因敲除的小鼠模型也得到了有力證實[8]。

4.2SLC26A4基因與KCNJ10基因 2009年Yang等[27]發(fā)現(xiàn)內(nèi)向整流鉀離子通道KCNJ10是EVA/PS致病因子中另一個重要的遺傳因素。他們對89例SLC26A4只有單等位基因突變的EVA/PS患者進行KCNJ10基因序列篩查時發(fā)現(xiàn)2例患者具有KCNJ10單等位基因的突變。在利用電壓鉗技術(shù)對這兩個突變產(chǎn)物進行電生理檢測時顯示：這兩個突變產(chǎn)物與野生型KCNJ10的產(chǎn)物相比，鉀離子通道的導(dǎo)電活性明顯降低，而此鉀離子電導(dǎo)活性是維持內(nèi)耳靜息電位必不可少的關(guān)鍵因素，對聽覺功能至關(guān)重要[28, 29]。在小鼠模型中Yang等[27]還發(fā)現(xiàn)SLC26A4突變導(dǎo)致了KCNJ10基因在耳蝸血管紋處表達明顯減少，表明這兩個基因之間存在著病理上的聯(lián)系；他們推測，SLC26A4突變后將導(dǎo)致內(nèi)淋巴液離子環(huán)境的改變，局部環(huán)境的改變選擇性地降低了KCNJ10在血管紋處的表達，因而失去了維持內(nèi)耳靜息電位的基礎(chǔ)，這可能是耳聾發(fā)生的直接因素。不過SLC26A4突變?nèi)绾尉唧w導(dǎo)致KCNJ10基因表達減少的分子機制目前還不清楚。

5 結(jié)語

綜上所述，SLC26A4基因是引起EVA/PS的主要隱性遺傳基因，但不是EVA/PS病因的唯一基因因素；FOXI1及KCNJ10基因突變也可能參與EVA/PS的發(fā)?。荒壳皩ふ腋嗟腅VA/PS發(fā)病的基因及環(huán)境因素是研究的一大熱點。SLC26A4基因篩查發(fā)現(xiàn)，其突變譜和突變類型復(fù)雜多樣，不同種族及人群中的突變各具特點。中國是一個地域廣闊的多民族國家，要明確各個地區(qū)及民族的SLC26A4的突變特點，還需要更加廣泛和深入的篩查研究。SLC26A4基因所編碼的Pendrin蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其準(zhǔn)確的拓撲結(jié)構(gòu)信息對于研究Pendrin的功能和預(yù)測錯義突變的致病性非常重要，此領(lǐng)域的研究亟待加強。

SLC26A4在不同組織中表達，而在不同組織所發(fā)揮的離子轉(zhuǎn)運功能不同，其在各組織中的具體作用還不是十分明確。SLC26A4基因異常功能研究顯示，突變后的基因表達產(chǎn)物有以下幾種可能：①突變體蛋白在細胞內(nèi)運輸發(fā)生障礙而不能正確定位到細胞膜上；②能正確定位到細胞膜上但離子轉(zhuǎn)運功能發(fā)生嚴重障礙；③能正確定位到細胞膜上但離子轉(zhuǎn)運功能發(fā)生部分障礙(低功能突變)。此外，SLC26A4基因與其他基因在EVA/PS的疾病的發(fā)生機制中存在著重要聯(lián)系，EVA/PS是一種受多基因影響的復(fù)雜型遺傳性疾病。部分SLC26A4基因突變可能不影響突變蛋白本身的細胞內(nèi)定位和離子轉(zhuǎn)運功能，但可能干擾其與其它EVA/PS相關(guān)基因的相互結(jié)合與作用。有關(guān)這方面分子機制的研究將對EVA/PS耳聾的分子診斷與基因治療具有重要的意義。

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