孫希才 摘譯 葛榮明 審校

上海同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉科(上海 200065)

聲帶瘢痕是一個(gè)較難解決的臨床問(wèn)題，尚缺乏有效的治療手段，目前其主要的治療方法是向聲帶中注射填充物或細(xì)胞，試圖恢復(fù)聲帶淺層的振動(dòng)性。聲帶振動(dòng)受損主要是由于固有層細(xì)胞外基質(zhì)的中斷、膠原沉積增多、彈性纖維的丟失等引起。有證據(jù)表明聲帶注射細(xì)胞或基質(zhì)對(duì)恢復(fù)聲帶黏膜波的作用是有限的。另外，從人的聲帶中獲取成纖維細(xì)胞比較困難。現(xiàn)有的組織工程方法是將聲帶的成纖維細(xì)胞包被在一系列的支架上。用自體細(xì)胞來(lái)源的組織結(jié)構(gòu)工程代替聲帶被覆黏膜可能成為嚴(yán)重聲帶瘢痕的治療方式。實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的第一步是構(gòu)建類似于聲帶固有層和上皮層的三維細(xì)胞群基質(zhì)。切除聲帶瘢痕后，用新的有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)和上皮作為替代物，改善聲帶的振動(dòng)功能。本研究便是介紹一種新的組織工程方法來(lái)構(gòu)建聲帶被覆黏膜的替代物，以便恢復(fù)聲帶固有層和上皮的振動(dòng)功能。通過(guò)脂肪抽吸分離獲得的脂肪源干細(xì)胞是一種多功能干細(xì)胞，作為一種自體間質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源，已被廣泛用來(lái)產(chǎn)生軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和纖維細(xì)胞。脂肪源干細(xì)胞與骨髓源間質(zhì)干細(xì)胞具有相似的遺傳特征，可以分化成外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞。本研究假設(shè)脂肪源干細(xì)胞在氣體界面和特異性細(xì)胞因子的作用下可以分化成上皮細(xì)胞，而遠(yuǎn)離氣體界面的細(xì)胞則可以分化為成纖維細(xì)胞。其方法是從UCLA血庫(kù)獲取冷沉淀物，-70℃保存?zhèn)溆?。將解凍的冷沉淀物、牛凝血酶溶液以及?xì)胞懸液按4:1:1混合形成纖維蛋白-脂肪來(lái)源的干細(xì)胞膠。在Transwell培養(yǎng)基板上形成凝膠，將一定量的細(xì)胞懸液直接加在膠上形成氣體界面。可見(jiàn)在特定的生長(zhǎng)因子和氣體界面的培養(yǎng)下，整個(gè)三維培養(yǎng)基中可見(jiàn)膠原產(chǎn)生，在接近上皮層的細(xì)胞中膠原沉積較多；在表皮生長(zhǎng)因子和氣體界面培養(yǎng)下，E-鈣黏蛋白(一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物)在三維培養(yǎng)基中陽(yáng)性表達(dá)；在表皮生長(zhǎng)因子和氣體界面下培養(yǎng)8天后，培養(yǎng)基表面的細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)；在表皮生長(zhǎng)因子的作用下培養(yǎng)14天后，接近氣膠交界的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)較多的E-鈣黏蛋白表達(dá)，包埋在基質(zhì)中的細(xì)胞則無(wú)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，而波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)較明顯。波形蛋白是一種在間質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，聲帶固有層中的成纖維細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)波形蛋白。在三維培養(yǎng)基中表達(dá)波形蛋白的細(xì)胞位于表達(dá)E-鈣黏蛋白細(xì)胞的深層。本研究構(gòu)建了聲帶黏膜的組織工程替代物，三維的纖維蛋白和脂肪源干細(xì)胞的水凝膠與聲帶的固有層和黏膜層有著相似的顯微結(jié)構(gòu)和特性。在本研究中，成人脂肪源干細(xì)胞可以雙向分化成上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞系，并且具有組織結(jié)構(gòu)，表皮生長(zhǎng)因子和氣體界面是上皮分化的必備條件。本研究結(jié)果初步表明，利用組織工程制作聲帶替代物是可行的。