李 鵬 尹雅玲 盧光洲 趙繁榮 梁金英

枸杞多糖抑制對硫磷致血管內(nèi)皮功能損傷的研究*

李 鵬 尹雅玲△盧光洲 趙繁榮 梁金英

目的：探討枸杞多糖（LBP）抑制對硫磷（DNTP）所致的血管內(nèi)皮功能損傷的作用。方法DNHP與大鼠離體胸主動脈血管環(huán)（EVAPVR）和培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共孵30 min，以LBP為保護(hù)、以超氧化物歧化酶（SOD）為對照，檢測血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)（EDRR）、內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性（ECMP）及細(xì)胞培養(yǎng)液生化指標(biāo)。結(jié)果血管環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LBP（10 g/L）明顯減輕了DNTP（4.5 μmol/L）對血管EDRR的抑制作用；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LBP（10 g/L）明顯降低了ECMP，增加了細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和一氧化氮（NO）的含量、降低了丙二醛（MDA）的含量（均P<0.05），與SOD對照組的作用相當(dāng)。結(jié)論LBP可抑制DNTP所致的血管內(nèi)皮功能損傷，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

枸杞△ 多糖類 對硫磷 主動脈,胸 內(nèi)皮細(xì)胞 血管舒張 臍靜脈 氧化性應(yīng)激 大鼠,Sprague-Dawley

目前，對硫磷（DNTP）、辛硫磷、丙溴磷等有機(jī)磷（OPs）農(nóng)藥依然在我國農(nóng)村地區(qū)大量使用。雖然大多數(shù)農(nóng)民已經(jīng)注意預(yù)防急性O(shè)Ps中毒，但是長期低劑量接觸的OPs農(nóng)藥對機(jī)體產(chǎn)生的損傷并未引起足夠重視。本研究以大鼠離體胸主動脈血管環(huán)（EVAPVR）和培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為模型，觀察枸杞多糖（LBP）抑制DNTP所致血管內(nèi)皮功能損傷的作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級Sprague-Dawley大鼠，雄性，56只，35～50日齡，體質(zhì)量180～220 g（河南省實(shí)驗(yàn)動物中心）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HVUECV-304）、LBP、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、青霉素、鏈霉素（長沙力康生物有限公司）；DNTP（美國Sigma公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純；混合醋酸纖維濾膜（直徑25 mm，孔徑0.8 μm）、針頭式濾器（外徑25 mm、內(nèi)徑20 mm）購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；RM6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；全自動定量繪圖酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計與分組

1.2.1血管環(huán)實(shí)驗(yàn) 大鼠稱質(zhì)量，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，切斷雙側(cè)頸總動脈放血處死，開胸后快速取出胸主動脈置于4℃的K-H緩沖液中，并通以95%O2+5%CO2混合氣體。分離并去除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織，剪成3～4 mm長的血管環(huán)，將血管環(huán)移至含有K-H緩沖液（恒溫37℃，通以95%O2+5%CO2混合氣體）的浴槽，檢測血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能。血管環(huán)實(shí)驗(yàn)分7組：（1）正常對照組。（2）LBP（10 g/L）對照組。（3）DNTP對照組。（4）低劑量LBP保護(hù)組，LBP（0.1 g/L）＋DNTP。（5）中劑量LBP保護(hù)組，LBP（1 g/L）＋DNTP。（6）高劑量LBP保護(hù)組，LBP（10 g/L）＋DNTP。（7）SOD對照組，SOD（200 U/L）＋DNTP。實(shí)驗(yàn)中每組8個血管環(huán)，7組共需56個血管環(huán)，分別來自56只Sprague-Dawley大鼠,DNTP均為4.5 μmol/L。

1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn) HVUEC用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，用含有15%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（青霉素，100 U/mL；鏈霉素，100 U/mL；pH 7.4）制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液1次。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞生長至致密融合后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取生長良好的第3代內(nèi)皮細(xì)胞用消化液消化,棄消化液,加入培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液,對懸液做細(xì)胞計數(shù)，超凈臺下，將內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)底面的濾膜上（接種密度約為2×105個/cm2），檢測內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性。取細(xì)胞培養(yǎng)液檢測培養(yǎng)液中SOD、MDA及NO含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分7組，分組及給藥方法同血管環(huán)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中每組8個濾膜（濾膜上載有致密的內(nèi)皮細(xì)胞單層），7組共需56個濾膜。

1.3血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能的檢測 將處理好的離體胸主動脈血管環(huán)（EVAPVR）一端用不銹鋼鉤固定于浴槽內(nèi)，另一端連張力換能器，將血管的收縮與舒張反應(yīng)通過RM6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)進(jìn)行記錄。血管環(huán)與各組實(shí)驗(yàn)藥物孵育30 min，記錄血管環(huán)正常收縮反應(yīng)和乙酰膽堿（ACh）引起的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)（EDRR）。

1.4內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的測定 接種于濾膜的HUVEC繼續(xù)生長8～10 d，待濾膜上形成致密的內(nèi)皮細(xì)胞單層后，即可檢測內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性(ECMP)。濾膜上加入實(shí)驗(yàn)藥物，共孵30 min，然后濾膜用Hank’s緩沖溶液沖洗2次，置于針頭式濾器內(nèi)（有效濾過面積S=3.14 cm2）。針頭式濾器上孔接長頸儲液瓶（上腔），下孔接量筒（下腔）。上腔中加入5 g/L白蛋白液（液面距離濾膜高度維持在25 cm），蛋白液通過液體流動產(chǎn)生的牽引作用透過濾膜進(jìn)入下腔。平衡5 min后，收集5～10 min濾出液，測量濾出液容積，計算濾出液生成速度Jv，內(nèi)皮單層濾過系數(shù)Kf和滲透壓反射系數(shù)σ。每組8個濾膜，將各組實(shí)驗(yàn)藥物加到濾膜上與單層內(nèi)皮細(xì)胞孵育30 min，然后檢測Jv值、Kf值和σ值。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA及NO含量的測定 取不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，酶標(biāo)法檢測SOD、MDA及NO的含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢測水準(zhǔn)為雙側(cè)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1LBP對EVAPVR的Emax和EC50的影響 高劑量LBP保護(hù)組、SOD對照組與DNTP對照組比較，ACh引起的Emax明顯升高，ACh引起的EC50明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 LBP對EVAPVR的Emax和EC50的影響

表1 LBP對EVAPVR的Emax和EC50的影響

*P<0.05,表2、3同

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2.2LBP對ECMP的影響 高劑量LBP保護(hù)組、SOD對照組與DNTP對照組比較，Jv、Kf明顯降低，σ值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2LBP對ECMP的影響

表2LBP對ECMP的影響

組別 Jv(μL·min-1·cm-2)Kf(μL·min-1·cm-2·kPa-1)σ正常對照組（1）LBP對照組（2）DNTP對照組（3）低劑量LBP保護(hù)組（4）中劑量LBP保護(hù)組（5）高劑量LBP保護(hù)組（6）SOD對照組（7）F q（3）∶（4）（3）∶（5）（3）∶（6）（3）∶（7）27.34±0.55 28.43±1.98 38.88±0.78 36.74±0.76 29.59±0.64 27.40±0.76 26.86±0.78 30.47*2.51 2.96 4.59*4.51*12.03±0.46 12.11±0.60 19.86±0.54 19.74±0.23 16.23±0.13 12.06±0.39 12.79±0.66 28.21*2.67 3.34*4.54*4.32*0.61±0.03 0.60±0.02 0.27±0.03 0.28±0.02 0.44±0.05 0.53±0.02 0.59±0.02 27.66*2.59 3.45*4.49*4.52*

2.3LBP對HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響 高劑量LBP保護(hù)組、SOD對照組與DNTP對照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量降低，SOD含量和NO含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 LBP對HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中生化指標(biāo)的影響

表3 LBP對HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中生化指標(biāo)的影響

組別 MDA(μmol/L) SOD(kU/L) NO(μmol/L)正常對照組(1)LBP對照組(2)DNTP對照組(3)低劑量LBP保護(hù)組(4)中劑量LBP保護(hù)組(5)高劑量LBP保護(hù)組(6)SOD對照組(7)F q （3）∶（4）（3）∶（5）（3）∶（6）（3）∶（7）1.32±0.16 1.30±0.11 2.98±0.41 2.92±0.22 2.25±0.35 1.39±0.73 1.41±0.32 27.16*2.87 3.21 4.52*4.44*54.22±2.64 53.43±2.57 16.85±1.45 22.90±1.05 43.96±3.17 52.79±2.66 52.75±0.64 29.21*2.31 3.66*4.33*4.21*21.44±2.66 20.66±1.75 7.58±1.63 9.66±1.47 16.55±1.46 20.41±1.75 21.75±1.28 28.69*2.65 3.78*4.43*4.52*

3 討論

Mackness等[1-2]的調(diào)查顯示，長期在溫室里噴灑OPs農(nóng)藥的花工或用OPs農(nóng)藥浸泡羊毛的牧民，其體內(nèi)對硫磷酶-1（PON1）活性和水平明顯降低；Fo?kina等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期接觸過OPs農(nóng)藥的人有血壓增高、脂代謝紊亂、血管張力降低和心、腦血管的動脈粥樣硬化早期臨床表現(xiàn)。筆者此前的研究發(fā)現(xiàn)，OPs農(nóng)藥（DNTP）明顯損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，誘發(fā)多種血管性疾病（如動脈粥樣硬化、糖尿病等）[4-5]。血管內(nèi)皮功能的損傷是多種血管疾?。ㄈ鐒用}粥樣硬化、糖尿病等）形成的起始因素，本研究通過體外血管環(huán)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察了DNTP對血管內(nèi)皮功能的損傷作用以及LBP抑制DNTP的損傷作用。

Emax代表最大舒張百分率，Emax越大，內(nèi)皮依賴性舒張功能越強(qiáng)；EC50代表半效應(yīng)濃度，EC50越大，內(nèi)皮依賴性舒張功能越差。本研究發(fā)現(xiàn)，LBP（10 g/L）明顯抑制了DNTP（4.5 μmol/L）引起的內(nèi)皮依賴性舒張功能下降。Jv、Kf和σ值是反映ECMP的指標(biāo)。Jv表示單位時間內(nèi)從單位面積內(nèi)皮細(xì)胞單層上濾出的液體量，可間接反映內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性，Jv值越大，通透性越高；Kf是內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的參數(shù)，直接反映內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性，Kf值越大，通透性越高；σ值指滲透壓反射系數(shù)，反映的是內(nèi)皮單層對大分子物質(zhì)的通透性，σ值越小，通透性越高。本研究顯示，LBP（10 g/L）明顯抑制了DNTP（4.5 μmol/L）所致的ECMP的升高。MDA、SOD、NO是檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化還原指標(biāo)的常用參數(shù)。本研究表明，LBP（10 g/L）明顯抑制了DNTP（4.5 μmol/L）引起的細(xì)胞培養(yǎng)液中氧化性指標(biāo)上升，提示LBP抑制DNTP對內(nèi)皮功能的損傷與觸發(fā)“氧化應(yīng)激”反應(yīng)有關(guān)，但其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

枸杞是我國傳統(tǒng)中藥材，《本草綱目》中記載枸杞具有“補(bǔ)精氣諸不足，明目安神，令人長壽”的功效?，F(xiàn)在藥理學(xué)研究證明，枸杞具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖等作用[6-8]。經(jīng)紅外光譜推測LBP可能含-OH、-COOH、-NH2-或-NH-基團(tuán)。通過理化性質(zhì)分析，證明LBP中不含蛋白質(zhì)、淀粉和還原糖的酸性多糖。本實(shí)驗(yàn)證明了LBP有明顯的抗氧化作用，可以有效抑制由OPs引起的對機(jī)體的慢性損傷。

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Study of Inhibitory Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on Damnification of Blood Vessel Endothelium Function Induced by DNTP

LI Peng,YIN Yaling,LU Guangzhou,ZHAO Fanrong,LIANG Jinying

Pharmacy College,Xin xiang Medical University,Henan 453003,China

Objective:To explore the mechanism of inhibitory effect of lycium barbarum polysaccharide(LBP)on dam?nification of blood vessel endothelium function induced by parathion(DNTP).Methods:The isolated rat thoracic aortic rings(EVAPOR)and cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)were incubated with DNTP for 30 min.LBP was used for protective effect and the level of superoxide dismutase(SOD)was used as the control.The endothelial-dependent re?laxation reaction(EDRR),endothelial cell monolayer permeability(ECMP)and biochemical index were detected.Results:The result of the vascular circle experiment showed that LBP(10 g/L)obviously reduced the inhibitory effect of DNTP(4.5 μmol/L)on vascular EDRR.The result of cell experiment showed that LBP(10 g/L)obviously reduced the ECMP and MDA,and increased the level of SOD and nitric oxide(P<0.05,respectively).These effects were corresponded with the SOD con?trol.Conclusion:LBP inhibited the damnifivation of blood vessel endothelium function induced by DNHP,which may be re?lated to the oxidative stress.

LYCIUM BARBARUM polysaccharides parathion aorta,thoracic endothelial cells vasodilation umbilical veins oxidative stress rats,Sprague-Dawley

*河南省教育廳2010年度自然科學(xué)研究計劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2010B330002）；河南省重點(diǎn)學(xué)科開放性課題（課題編號：ZD200906）

453003 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（李鵬，盧光洲，趙繁榮，梁金英），基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（尹雅玲）

△通訊作者 E-mail：hnpdsyyl@163.com

(2010-05-18收稿 2010-09-06修回)

（本文編輯 李國琪）