高 靜 王 慧 牛文彥

JNK在棕櫚酸致骨骼肌細胞胰島素抵抗中的作用*

高 靜 王 慧 牛文彥△

目的:探討棕櫚酸造成L6GLUT4myc骨骼肌細胞胰島素抵抗過程中c-Jun N-末端激酶(JNK)所起的作用。方法:將L6GLUT4myc成肌細胞培養(yǎng)于24孔和6孔培養(yǎng)板中，隨機分為溶劑組和棕櫚酸組，分別用0.3 mmol/L的棕櫚酸鹽和溶劑牛血清白蛋白（BSA）孵育16 h，在棕櫚酸組的后30 min加入JNK的抑制劑，于胰島素刺激前后用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）細胞膜上GLUT4myc的含量，免疫印跡法測定蛋白激酶B(Akt)、JNK和胰島素受體底物1（IRS1）的磷酸化。結果與溶劑組相比，棕櫚酸組中胰島素增加的GLUT4myc水平的倍數(shù)和Akt的磷酸化降低(P<0.05)；JNK和IRS1的絲氨酸位點S307的磷酸化水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論棕櫚酸導致L6骨骼肌細胞胰島素抵抗的機制可能不涉及JNK，或JNK的作用很小。

棕櫚酸 肌,骨骼 葡萄糖轉運體4型 胰島素 胰島素抗藥性 JNK絲裂原活化蛋白激酶類 蛋白激酶類

棕櫚酸是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸，其造成骨骼肌胰島素抵抗的機制尚不明確。在骨骼肌中，胰島素刺激的葡萄糖攝取主要由位于細胞膜上的葡萄糖轉運子4(glucose transporter 4,GLUT4)轉運。其信號機制為胰島素與其受體結合，磷酸化胰島素受體底物1（IRS1）的酪氨酸位點，進而激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），激活蛋白激酶B(Akt)，最終傳遞信號到GLUT4[1]。c-Jun N-末端激酶(JNK)可磷酸化IRS1的絲氨酸位點S307,從而抑制IRS1的酪氨酸磷酸化，參與造成胰島素抵抗的機制。本研究通過檢測細胞膜上的GLUT4myc和Akt、JNK和IRS1的磷酸化水平，探討JNK在棕櫚酸造成骨骼肌胰島素抵抗機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 L6大鼠骨骼肌細胞株（L6GLUT4myc）由加拿大Amira Klip教授提供。Hanks液、α-MEM（天潤善達公司），胎牛血清、胰酶（以色列Bioind公司），胰島素（加拿大Eli Lilly公司），Sodium Palmitate和抗myc表位抗體（美國Sigma公司），不含脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA，瑞士Roche公司），山羊血清（加拿大Wisent公司），抗磷酸化Akt和JNK抗體（美國Cell Sig?naling公司）。偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗體、驢抗鼠IgM抗體（美國Jackson Immuno Research公司），增強化學發(fā)光底物檢測試劑盒（美國Millipore公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)L6GLUT4myc成肌細胞，將接種在24孔和6孔培養(yǎng)板中的細胞用含1%胎牛血清的培養(yǎng)基分化為多核肌管，隔天換液，接種后第6天用于實驗。

1.2.2細胞膜GLUT4myc的測定 將24孔板的細胞隨機分為溶劑組和棕櫚酸組，分別加入600 μL 0.9%的BSA和0.3 mmol/L的棕櫚酸預孵育16 h。溶劑組分為胰島素亞組和基礎亞組；棕櫚酸組分為胰島素亞組、胰島素+抑制劑（JNK的抑制劑SP600125，10 μmol/L）亞組和基礎亞組，每亞組設有3個平行的復孔。2組中胰島素亞組各加入胰島素，使其最終濃度達到100 nmol/L，基礎組不加胰島素。處理細胞后，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定細胞膜上的GLUT4myc。多聚甲醛固定，甘氨酸淬滅，體積分數(shù)為5%（V/V）的山羊血清封閉后，用抗myc表位抗體室溫孵育1 h；用HRP的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h；加入底物鄰苯二胺溶液，反應約20 min后終止，用酶標儀測定上清液492 nm的吸光度值，重復4次。增加的細胞表面GLUT4myc水平=胰島素組吸光度值/基礎組的吸光度值。

1.2.3Akt、JNK和IRS1的磷酸化檢測 在6孔板上，將細胞分為溶劑組和棕櫚酸組，每組2孔。分別用溶劑BSA和0.3 mmol/L的棕櫚酸預孵育16 h。各組的其中1孔加入1 mL，100 nmol/L胰島素，另1孔不加胰島素作為基礎組。處理細胞后，裂解細胞，65℃加熱15 min，于體積分數(shù)為7.5%(V/V)SDS-PAGE進行電泳，免疫印跡檢測Akt、JNK和IRS1的磷酸化水平，一抗用各自的磷酸化抗體，二抗用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，以Actin1作為內(nèi)參，增強化學發(fā)光底物試劑盒檢測，曝光，重復4次。用Image J軟件處理，各蛋白的磷酸化水平增高倍數(shù)=胰島素組灰度值/基礎組的灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析 對符合正態(tài)分布的正態(tài)計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)間的差異用t檢驗比較，用單因素方差分析比較多組均數(shù)間的差異，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組胰島素增加的GLUT4myc水平的比較 與溶劑組相比，棕櫚酸組胰島素刺激后細胞膜上增加的GLUT4myc的水平顯著降低（P<0.01），但抑制劑JNK沒有逆轉此現(xiàn)象，見表1。

2.2棕櫚酸對Akt、JNK和IRS1磷酸化的影響 溶劑組中的胰島素刺激后Akt磷酸化水平增高倍數(shù)較棕櫚酸組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2、圖1；而2組中胰島素刺激后JNK和IRS1的磷酸化水平增高比較差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），見表2，圖2、3。

表1 各組中胰島素增加細胞表面GLUT4myc水平的比較 （n=12，倍

表1 各組中胰島素增加細胞表面GLUT4myc水平的比較 （n=12，倍

**P<0.01

組別 相對于各基礎亞組的倍數(shù)統(tǒng)計學處理組比 P溶劑組棕櫚酸組F基礎亞組（1）胰島素亞組（2）基礎亞組（3）胰島素亞組（4）胰島素+抑制劑亞組（5）1.00±0.00 2.08±0.12 1.00±0.00 1.48±0.02 1.49±0.09 62.936**（1）∶（2）（2）∶（4）（4）∶（5）<0.001<0.001 0.848

表2 2組中Akt、JNK和IRS1磷酸化水平增高倍數(shù)的比較 （倍

表2 2組中Akt、JNK和IRS1磷酸化水平增高倍數(shù)的比較 （倍

**P<0.01

組別 n Akt JNK IRS1溶劑組棕櫚酸組t 44 9.60±1.87 5.29±0.98 4.08**3.11±0.52 2.82±0.46 0.84 2.36±0.24 2.13±0.05 1.87

圖3棕櫚酸對L6GLUT4myc細胞IRS1磷酸化的影響

3 討論

肥胖是導致糖尿病的重要危險因素，肥胖的脂肪組織分泌過多的脂肪酸，其中飽和脂肪酸棕櫚酸可影響胰島素調(diào)節(jié)骨骼肌攝取葡萄糖的作用[2-3]。本研究應用L6GLUT4myc骨骼肌細胞株，檢測棕櫚酸鹽直接孵育對胰島素調(diào)節(jié)GLUT4myc轉位和Akt磷酸化的影響，并進一步分析了JNK在此機制中的作用。

本研究結果顯示棕櫚酸抑制胰島素刺激的Akt磷酸化和GLUT4myc轉位，表明棕櫚酸削弱胰島素信號。但JNK是否參與棕櫚酸造成的胰島素抵抗，其探求機制就是否涉及棕櫚酰輔酶A尚存爭議。棕櫚酸首先生成棕櫚酰輔酶A，其主要在絲氨酸棕櫚酰轉移酶（SPT）的作用下生成神經(jīng)酰胺，并可生成少量的其他代謝產(chǎn)物，如二酰甘油（DAG）。SPT是生成神經(jīng)酰胺的限速酶，用小RNA干擾方法抑制SPT的合成，則神經(jīng)酰胺的合成量減少，DAG的合成量相應增多。增多的DAG會激活受其調(diào)節(jié)的PKC，進而激活JNK而間接增加IRS1的絲氨酸位點S307的磷酸化[4]。本研究結果顯示，棕櫚酸并不影響JNK和IRS1的絲氨酸位點S307的磷酸化，提示JNK可能不參與棕櫚酸造成的胰島素抵抗。但也可能是JNK參與此機制，而由于棕櫚酸主要生成神經(jīng)酰胺，DAG的合成量較少，因此JNK的作用較難檢測。有報道用神經(jīng)酰胺孵育L6細胞，發(fā)現(xiàn)IRS1的酪氨酸磷酸化水平?jīng)]有降低，PI3K的活性也沒有變化，但卻降低了胰島素增加的GLUT4的水平和葡萄糖攝取，造成胰島素抵抗[5]，表明神經(jīng)酰胺并沒有通過IRS1和PI3K這2個胰島素上游信號分子造成胰島素抵抗，與本研究結果一致。神經(jīng)酰胺抑制胰島素誘導的Rac的激活以及肌動蛋白（Actin）的重塑，同時抑制Akt的磷酸化[5]。Akt激活的一個關鍵步驟是其轉位到質(zhì)膜上，神經(jīng)酰胺會通過PKCζ抑制此作用[2]。這些與本研究顯示的棕櫚酸抑制胰島素刺激的Akt磷酸化結果相符。綜上，棕櫚酸主要生成神經(jīng)酰胺，調(diào)節(jié)GLUT4轉位，檢測棕櫚酸對胰島素調(diào)節(jié)的Actin重塑的影響，可進一步驗證JNK的作用。

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The Role of JNK in the Palmitate-Induced Insulin Resistance in Skeletal Muscle Cells

GAO Jing,WANG Hui,NIU Wenyan

Department of Immunology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To study the role of c-jun N-terminal kinase(JNK)in the mechanism of palmitate-induced insu?lin resistance in L6GLUT4myc skeletal muscle cells.Methods:L6GLUT4myc myoblasts were incubated in 24 and 6 wells plates and divided into two groups,and treated with 0.3 mmol/L palmitate or solvent BSA for 16 h,respectively.JNK inhibi?tor was added to the medium during the last 30 min incubation with palmitate or BSA.The amount of GLUT4myc on the cell surface was measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and the phosphorylation of protein kinase B(Akt).JNK and insulin receptor substrate1(IRS1)were measured by immunoblotting in the absence or presence of insulin respec?tively.Results:Compared to the solvent group,insulin-stimulated GLUT4myc translocation and phosphorylation of Akt de?creased in palmitate group(P<0.05).There was no significant difference in the phosphorylation of JNK and IRS1 pS307.Conclusion:Palmitate causes insulin resistance in L6 muscle cells,and JNK may not be involved in its mechanism.

palmitic acid muscle,skeletal glucose transporter type 4 insulin insulin resistance JNK mito?gen-activated protein kinases protein kinases

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：30570912）；國家自然科學基金委員會-加拿大衛(wèi)生研究院健康研究合作計劃項目（項目編號：30611120532）；天津市科委科技支撐計劃項目（項目編號：09ZCZDSF04500）

300070 天津醫(yī)科大學免疫教研室

△通訊作者 E-mail：wniu@tijmu.edu.cn

（2010-09-28收稿 2010-11-15修回）

（本文編輯 魏杰）