陳相達(dá)，戴慧慧，劉燕，李圓圓，翁叢叢，茹波，曾愛兵

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學(xué)院；2.生命科學(xué)學(xué)院）

一株高產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

陳相達(dá)1，戴慧慧1，劉燕1，李圓圓1，翁叢叢1，茹波1，曾愛兵2

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.仁濟學(xué)院；2.生命科學(xué)學(xué)院）

目的：篩選出α-淀粉酶高產(chǎn)菌株，對其發(fā)酵特性及分類鑒定進(jìn)行研究，為豐富產(chǎn)淀粉酶菌種資源和進(jìn)一步挖掘該菌株的應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。方法：通過初篩、復(fù)篩獲得高酶活菌株XW86，利用傳統(tǒng)的形態(tài)觀察、系統(tǒng)生理生化反應(yīng)并結(jié)合16S rDNA的序列分析，經(jīng)Blast序列比對構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定其分類定位。通過單因素選擇實驗以及進(jìn)一步的正交實驗和多因素交互實驗，進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。結(jié)果：XW86與已報道的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisstrain QD517）親緣關(guān)系最近，二者的16S rDNA序列相似性為99%，生理生化反應(yīng)譜與16S rDNA序列分析一致鑒定為枯草芽孢桿菌。XW86最適產(chǎn)酶條件為：在LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.75%吐溫、0.5%淀粉，初始pH 6.5，35 ℃培養(yǎng)120 h。液體發(fā)酵得到的粗酶液酶活可高達(dá)2200 U/dL，比優(yōu)化前提高2.8倍。結(jié)論：初步鑒定XW86為枯草芽孢桿菌，產(chǎn)酶因素的最佳組合對其淀粉酶活性有很大的優(yōu)化空間。該野生型菌株可為淀粉酶發(fā)酵工業(yè)新備選菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，也為進(jìn)一步克隆獲得產(chǎn)淀粉酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

α-淀粉酶；枯草芽孢桿菌；條件優(yōu)化；鑒定

α-淀粉酶能分解淀粉為糊精、低聚糖和單糖類[1]，它是最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的一類酶制劑品種，占據(jù)了工業(yè)化酶制劑市場約25%的市場價額，廣泛用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)，幾乎完全替代了化合試劑在淀粉工業(yè)中的使用[2-3]。如何在自然界中篩選更多更好的產(chǎn)淀粉酶菌株，以及如何提高菌株的產(chǎn)酶性能是受到普遍關(guān)注的問題。國外著名公司novozyme及genencor不斷推出新的優(yōu)良菌株[4]，這勢必對我國酶制劑行業(yè)造成一定的壓力，因此開發(fā)新的菌株具有十分重要的意義。為此，本研究從浙江省溫州市區(qū)16個不同地點采樣篩選解淀粉菌株，獲得了一株高產(chǎn)α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌XW86，初步研究了XW86液體發(fā)酵的產(chǎn)酶特性和分類鑒定， 為豐富產(chǎn)淀粉酶菌種資源和進(jìn)一步挖掘該菌株的應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 樣品：采自浙江省溫州市米店、面粉廠、面粉店、食堂洗米點、食堂面粉儲備庫附近等16處富含淀粉質(zhì)的土壤和表面積垢共28份。固體標(biāo)本每份約25 g，裝入無菌培養(yǎng)皿中。表面積垢用無菌棉簽擦拭后投入含玻璃珠9 mL無菌水管中，作為原液。均要立即送檢，當(dāng)天處理完畢。

1.1.2 培養(yǎng)基：LB淀粉平板[5]和LB淀粉液體培養(yǎng)基（蛋白胨1%；牛肉膏0.3%；NaCl 0.5%；可溶性淀粉 0.2%）[6]。

1.1.3 主要試劑：細(xì)菌總DNA提取試劑盒（艾思進(jìn)）；PCR反應(yīng)體系所需試劑均為上海生工產(chǎn)品；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米淀粉購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠等。

1.2方法

1.2.1 菌株的分離和初篩：將土壤樣品10 g放入帶有玻璃珠100 mL無菌水的三角瓶中，搖床200 r/min，15 min，懸液記做10-1土壤稀釋液。吸取10-1的土壤稀釋液1.0 mL加入到9 mL的無菌水中，吹吸數(shù)次混勻即為10-2稀釋液。依次稀釋制成10-3、10-4、10-5的稀釋液。擦拭液稀釋成10-1、10-2、10-3三個稀釋度。各取三個不同稀釋度固體和擦拭液樣本100μL分別涂布在LB固體平板上，培養(yǎng)后獲取單個菌落。挑取不同菌落特征的克隆，平行轉(zhuǎn)接到選擇性培養(yǎng)基上，利用碘染色逐日觀察淀粉的降解動態(tài)，連續(xù)5 d選擇有酶活的菌株并編號保存[7]。

1.2.2 復(fù)篩菌株的酶活測定實驗：用碘-淀粉二點比色法篩選獲得的部分菌株再用DNS法進(jìn)行淀粉酶活測定，記錄吸光度數(shù)據(jù)，探索酶活變化規(guī)律。同時每日傳代被選菌株40 d，測定其傳代后酶活的穩(wěn)定性。①碘-淀粉二點比色法[8-9]：取37 ℃新鮮培養(yǎng)一定時間的菌懸液1 mL，8000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液。0.5 mL粗酶液加入9.5 mL的蒸餾水，此稀釋液為測定樣本。測定波長為660 nm，蒸餾水調(diào)零，讀取吸光度。酶活單位定義：100 mL樣本，在37 ℃，15 min水解淀粉酶5 mg為一個酶活力單位。計算公式為BV=（OD0-OD1）/OD0×S×N×100/0.2=（OD0-OD1）/OD0×0.4/5×15/7.5×100/0.2=（OD0-OD1）/OD0×80×N，式中：BV為酶活單位；S=反應(yīng)系統(tǒng)中的淀粉量（mg）；N=酶液稀釋倍數(shù)；OD0=空白對照讀數(shù)；OD1=樣品管的光密度讀數(shù)。100為100 mL的量，0.2 mL為酶液取樣量。②DNS法[10]：用碘-淀粉二點比色法篩選后的部分標(biāo)本再用DNS進(jìn)一步測定其酶活性，篩選出高酶活菌株。標(biāo)本本實驗設(shè)定40 ℃時在5 min內(nèi)水解淀粉釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。計算酶活力的公式為:酶活力單位=C酶×V酶×n。式中C酶為酶液中麥芽糖的濃度；V酶為提取酶液的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)。利用麥芽糖梯度標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包計算回歸方程，求出相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.2.3 細(xì)菌種屬鑒定：①傳統(tǒng)形態(tài)和生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，通過革蘭氏染色，形態(tài)觀察，選擇芽孢桿菌鑒定試條（法國生物梅里埃VITEK），通過自動化系統(tǒng)生理生化譜分析作出鑒定結(jié)果[11-12]。②16S rDNA的PCR擴增和序列分析[13]：采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取菌株基因組DNA。根據(jù)不同種屬細(xì)菌的16S rDNA序列兩端的保守性設(shè)計通用引物。正引物F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反引物R：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。利用PCR特異性擴增16S rDNA序列，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變熱5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)33次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下出現(xiàn)1.5 kb左右的單一明亮的條帶，證明已擴增到目的序列，產(chǎn)物送交上海鼎安生物技術(shù)有限公司測序。測序得到的16S rDNA基因序列應(yīng)用ClustalW軟件對目的序列進(jìn)行多序列比對，然后采用MEGA4.0軟件中的鄰位相算法（NJ法）和bootstrap 1000次，構(gòu)建XW86的16S rDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，最終確定菌株的進(jìn)化地位。

1.2.4 菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化：①單因素選擇實驗：分別以不同氮源、碳源、表面活性劑、溫度、pH、金屬離子對產(chǎn)酶的影響進(jìn)行選擇。②發(fā)酵條件的優(yōu)化、正交試驗[14-15]：根據(jù)單因素選擇實驗結(jié)果，選擇三因素三水平進(jìn)行正交實驗和多因素交互作用試驗，運用統(tǒng)計學(xué)方法計算平均值和極差決定酶活最佳條件組合，最后確定酶活最佳條件。

1.2.5 液體發(fā)酵條件優(yōu)化前后酶活的比較：同時測定最佳條件下與基礎(chǔ)培養(yǎng)基常規(guī)條件的菌株發(fā)酵液酶活單位，分別得出其最高酶活，重復(fù)三次，計算酶活提高率。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離和初篩方法 樣品經(jīng)稀釋后挑取不同菌落特征的克隆，共篩選出330個菌株。利用平板碘染色逐日觀察淀粉的降解動態(tài)5 d，共收集有酶活的菌株86株。

2.2 復(fù)篩和菌株的酶活穩(wěn)定性測定結(jié)果 用碘-淀粉二點比色法從86株初篩菌株中篩選出較高酶活菌株20株。再用DNS進(jìn)行淀粉酶活性測定，回歸方程為Y=0.013X-0.081，r=0.9991186，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.16。用配對t檢驗對兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。最終我們確定2株酶活性較高的菌株（命名XW82號、XW86號）。將酶活較高的兩菌株同步傳代40代并逐代進(jìn)行酶活測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XW82號菌株續(xù)傳32代后酶活大幅下降，酶活力低于100 U/dL（DNS法），XW86號菌株續(xù)傳40代仍保持高酶活。

2.3 菌圈比與酶活 我們選擇20株有酶活的菌株測定它第3天的菌圈大小和粗酶液的酶活（DNS法）比探討它們的相關(guān)性。數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果R2=0.441，P=0.001。

2.4 細(xì)菌種屬鑒定

2.4.1 傳統(tǒng)形態(tài)和生理生化鑒定：將XW86原始菌株在LB淀粉固體培養(yǎng)基上分區(qū)劃線培養(yǎng)獲取單個菌落，24 h后菌落直徑可達(dá)4～6 mm，乳白色，不透明，邊緣不整齊，迎光觀察呈白蠟狀。各菌落沿劃線蔓延呈長線片狀。革蘭染色油鏡觀察為革蘭陽性，菌體粗大，長桿狀，可見橢圓形芽胞位于菌體中間和次極端，呈長鏈狀排列。生化鑒定由VITEK系統(tǒng)自動分析和儲存BAC試條鑒定，生化反應(yīng)結(jié)果符合Bacillus subtilis。

2.4.216 S rDNA的PCR擴增和序列分析：從16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖可看出PCR得到的擴增產(chǎn)物約為1.5 kb，符合16S rDNA片斷大小。由上海鼎安生物技術(shù)有限公司序列測定得16S rDNA序列為1461 bp，見圖1。將序列上傳到Genebank，申請登錄號為（Accession No.GU248527）。將測序得到的16S rDNA基因序列應(yīng)用ClustalW軟件對目的序列進(jìn)行多序列比對，然后采用MEGA4.0軟件中的鄰位相算法（N-J法）和bootstrap 1000次，構(gòu)建XW86 16S rDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹確定XW86進(jìn)化地位，見圖2?？梢钥闯鼍闤W86與Bacillus subtilis聚為一類，同源性達(dá)99%以上，與strain QD517的親緣關(guān)系最近。

圖1 XW86 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 XW86菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 單因素選擇實驗：氮源中1%黃豆粉對XW86產(chǎn)酶最有利，1%尿素也有一定作用；碳源2%淀粉量對產(chǎn)酶最好，麩皮也有較好的表現(xiàn)，玉米漿也有利于產(chǎn)酶但相對不明顯；培養(yǎng)基初始pH 6.5時產(chǎn)酶效果較好；發(fā)酵培養(yǎng)溫度35 ℃時酶活性較高，溫度升高酶活有所下降；基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加0.75%吐溫-80對XW86菌株酶活明顯有促進(jìn)作用。產(chǎn)酶時間XW86酶活在3～5 d達(dá)高峰，6 d后酶活逐漸回落。

2.5.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化、正交試驗：根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，各因素對產(chǎn)酶的影響次序為吐溫＞溫度＞鈣離子＞可溶性淀粉＞尿素＞pH。然后選擇三因素三水平正交實驗分析，組合見表1。結(jié)果各因素交互作用并不明顯，數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。通過27組合均值和極差直觀分析研究，以A3B1C2為最佳組合，即培養(yǎng)基為含0.75%吐溫，0.5%淀粉LB發(fā)酵液，初始pH 6.5，35 ℃培養(yǎng)時間120 h。液體發(fā)酵優(yōu)化前后酶活比較試驗也證實了這一點。

表1 L8（26）正交表

2.5.3 液體發(fā)酵條件優(yōu)化前后酶活的比較：各條件因素優(yōu)化組合的液體發(fā)酵粗酶液酶活可高達(dá)2200 U/dL（DNS法），比優(yōu)化前提高2.8倍。

3 討論

3.1 使用傳統(tǒng)鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)菌 16S rDNA存在于所有的原核生物，具有高度的保守性，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的分子鐘，素有“細(xì)菌化石”之稱。依據(jù)細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)可的原則：16S rDNA全序列同源性大于97%為屬內(nèi)同一種，當(dāng)小于93%～95%為屬外成員。從16S rDNA基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，XW86與Bacillus subtilisQD517 16S rDNA存在99%的同源性，最終確定XW86為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與其相應(yīng)的形態(tài)特征、生理生化特征相吻合。

3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化與正交試驗 根據(jù)L8（26）正交實驗結(jié)果分析，各因素交互作用不明顯，數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各因素對XW86可能不是絕對優(yōu)勢因素，只占部分影響。各條件因素的優(yōu)化組合液體發(fā)酵粗酶液酶活可高達(dá)2200 U/dL，比優(yōu)化前提高2.8倍，表明產(chǎn)酶因素的最佳組合對其產(chǎn)淀粉酶活性有很大的優(yōu)化空間。

3.3 兩種測定酶活方法相結(jié)合使復(fù)篩過程既快速又準(zhǔn)確 碘-淀粉二點比色法，顯色不穩(wěn)定，線性差，但操作簡單省時，適合大批量標(biāo)本的快速檢測。DNS法雖操作繁瑣但顯色穩(wěn)定，線性好。故兩種方法相結(jié)合測定酶活更為合理。

3.4 菌圈比與酶活的關(guān)系 我們選擇20株有酶活的菌株測定它第3天的菌圈大小和粗酶液的酶活比（DNS法）探討它們的相關(guān)性。數(shù)據(jù)進(jìn)行了線性回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性很低，說明菌圈比只能作為酶活高低的參考指標(biāo)，而不是確切指標(biāo)。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，α-淀粉酶的研究也深入到分子水平，主要包括基因的克隆和異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因的體外誘變以及結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系等。我們也即將展開菌株淀粉酶的克隆與重組等分子生物學(xué)研究。

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Screening and identification of a wildBacillus subtiliswith high amylase activity and optimization of its enzyme-producing conditions

CHEN Xiangda*，DAI Huihui，LIU Yan，LI

Yuanyuan， WENG Congcong， RU Bo，ZENG Aibing.
*Renji College， Wenzhou Medical College，Wenzhou， 325035

Objective:To screen a bacterial strain of α-amylase-producing，to study its highyielding fermentation characteristics and its identification and lay the foundation for enriching the resources of α-amylase producing and lapping further the applied value of this strain.Methods:Normal culture and isolation were performed to isolate the strains. The amylase activity was analyzed via screening and re-screening. The strains were identified according to the traditional morphological，physiological and biochemical character-istics as well as 16S rDNA sequence similarity analysis against the genes of retraived form Genbank. The single-factor and orthogonal experiments were performed to determine the optimal conditions for enzymatic production.Results:On the basis of the physiological and biochemical characteristics as well as 16Sr DNA sequence analysis， the isolate was identified as a species ofBacillus subtilisand named XW86. It had the closet relationship with the previously reportedBacillus subtilis（Bacillus subtilisstrain QD517），and their 16S rDNA sequence similarity reached upto 99%. The optimal enzyme-producing conditions for XW86 were as follows: LB medium with 0.5% starch and 0.75% Tween-80， initial pH 6.5，incubation at 35 ℃ for 120 h. The crude extract enzymatic activity from liquid fermentation could reach as high as 2200 U/dL，and it increased 2.8 times compared with that before optimization.Conclusion:XW86 strain is preliminarily identified asBacillus subtilis. Under the optimal growth conditions，the amylase-producing activity is greatly increased. The further improvement of the wild-type strain may provide the resources for an alternative in amylase fermentation industry.

α-amylase；Bacillus subtilis；optimal growth conditions；identification

Q939

A

1000-2138 （2011）01-0040-05

2010-04-12

陳相達(dá)（1986-），男，浙江永嘉人，本科生。

曾愛兵，高級實驗師，Email：zab5@163.com。

丁敏嬌）

·論 著·