季愛(ài)加,寧喜斌

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是由日本學(xué)者下村修[1]于1962年從多管水母(Aequorea victoria)中發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種發(fā)光蛋白。分子質(zhì)量為26 ku,是由238個(gè)氨基酸構(gòu)成的“β-桶”型三維立體結(jié)構(gòu),其中第65～67位氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成發(fā)光團(tuán),為主要發(fā)光的位置。GFP的結(jié)構(gòu)賦予了其一些獨(dú)特的性質(zhì)[2]:熒光穩(wěn)定、檢測(cè)方便、無(wú)種屬特異性、不需任何反應(yīng)底物和輔助因子、易于構(gòu)建載體,并且它不會(huì)破壞細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境,對(duì)細(xì)胞生理功能無(wú)影響等,因此是常用的報(bào)告基因。目前,科研人員根據(jù)不同需要,利用氨基酸序列修飾等方法對(duì)GFP進(jìn)行改進(jìn),獲得了一系列優(yōu)良的變異體,發(fā)光的強(qiáng)度和顏色都有變化,如苯丙氨酸64被亮氨酸取代,絲氨酸65被蘇氨酸取代的EGFP熒光強(qiáng)度就增加了35倍。而且出現(xiàn)了紅色、黃綠色、藍(lán)色等多種顏色的熒光蛋白,大大拓寬了GFP研究的領(lǐng)域[3]。近些年,國(guó)內(nèi)外掀起了關(guān)于GFP研究的熱潮,已見(jiàn)GFP應(yīng)用于各人源細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌等領(lǐng)域中[4-7]。本研究以原核生物E.coliBL21為表達(dá)宿主,利用PCR技術(shù)從模板EGFP-N3中克隆得到EGFP片段,并在其2端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ,對(duì)引入酶切位點(diǎn)的EGFP片段和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理,連接后得到重組質(zhì)粒pET28a-EGFP并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)可以高效表達(dá)。食品安全問(wèn)題一直是困擾各國(guó)的公共衛(wèi)生問(wèn)題,食源性病原菌又是引起食品安全問(wèn)題的主要因素之一。通過(guò)本研究,期望能夠?yàn)橐院驟GFP作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,跟蹤監(jiān)測(cè)病原菌的侵染路徑提供理論基礎(chǔ),從而為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 PEGFP-N3模板、菌株E.coliDH5α(用于質(zhì)粒的保存)、E.coliBL21(用于重組質(zhì)粒的表達(dá))、質(zhì)粒pET28a(復(fù)旦大學(xué)遺傳所);限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ,HindⅢ(紐英倫生物技術(shù)有限公司);T4DNA連接酶、1 kb DNA ladder(Fermentas公司);DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司);DNA純化試劑盒及IPTG(大連寶生物工程有限公司);PCR用試劑(北京全式金生物技術(shù)公司);卡那霉素、瓊脂糖及PCR合成引物等(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 PTC-200 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);Carl Zeiss Axio-Scope.A1落射熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss Jena);DYY-6C電泳槽和電泳儀(北京六一儀器廠);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);UV2300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EGFP基因的PCR擴(kuò)增和回收 以PEGFP-N3中EGFP片段為模板,設(shè)計(jì)上游引物:5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′,下游引物:5′-GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′。分別取4.0 μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0 μLTransStart FastPfuDNA polymerase(5 U/μL)、10μL 10×Buffer、5.0μL dNTPMixture作為PCR反應(yīng)體系。用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL,于95℃條件下預(yù)變性處理2 min,然后分別在94℃變性20 s、65℃退火20 s、72℃延伸30 s、最終72℃終延伸5 min,整個(gè)PCR反應(yīng)體系共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,用DNA純化試劑盒回收后待用。

1.2.2 EGFP基因和pET28a表達(dá)載體的限制性酶切處理 取上述經(jīng)DNA純化試劑盒純化后的目的片段作為PCR反應(yīng)的模板,設(shè)計(jì)引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物(5′-GGAG/AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′)和引入HindⅢ酶切位點(diǎn)的下游引物(5′-CCGA/AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,進(jìn)行DNA純化。純化后的EGFP片段進(jìn)行雙酶切[8],反應(yīng)體系如下:30 μL添加了酶切位點(diǎn)的EGFP片段、5μL 10×buffer2、1μLEcoRⅠ(20 U/μL)、1μLHindⅢ(20 U/μL),用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL后,于37℃下保溫1 h,然后在65℃條件下處理20 min進(jìn)行熱失活。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,DNA純化試劑盒純化回收。另一方面,將pET28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,切下線性質(zhì)粒條帶進(jìn)行純化回收。

1.2.3 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述含酶切位點(diǎn)的EGFP片段與線性pET28a質(zhì)粒按2◇1比例、在45℃下保溫5 min后,置于冰浴中冷卻,冷卻后分別加入1μL T4DNA連接酶、2μL 10×T4DNA連接酶緩沖液,16℃保溫16 h,如圖1所示。連接液轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)37℃培養(yǎng)過(guò)夜后,挑選3～5個(gè)菌落做PCR驗(yàn)證,進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定,陽(yáng)性克隆用于DNA測(cè)序。對(duì)經(jīng)測(cè)序確證的、含pET28a-EGFP重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提純。

圖1 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of recombinant expression vector pET28a-EGFP

1.2.4 EGFP基因的原核表達(dá)及檢測(cè) 取1μL“pET28a-EGFP”重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)37℃培養(yǎng)過(guò)夜后。隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性菌落克隆于含卡那霉素(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)液中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,并使其終濃度為1.0 mmol/L。將含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液于25℃、110 r/min條件培養(yǎng)12 h后,制成玻片于熒光顯微鏡下觀察,對(duì)在熒光顯微鏡下發(fā)綠光的大腸埃希菌及時(shí)保種,同時(shí),劃線至含卡那霉素(50 μg/mL)及IPTG(1 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h,觀察菌落形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將EGFP片段與pET28a表達(dá)載體經(jīng)連接液連接后,通過(guò)對(duì)挑取的單菌落做菌落PCR檢驗(yàn),如圖2所示,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,發(fā)現(xiàn)在約750 bp處有清晰條帶(圖2左),與理論相符,初步確定為陽(yáng)性克隆。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行提純、用EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,可在約750 bp處看到目的片段的條帶(圖2右)。最終將PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)與GenBank序列比對(duì),結(jié)果顯示序列匹配率為100%,由此可以證明目的片段“EGFP”已正確連接到pET28a表達(dá)載體,并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

2.2 重組表達(dá)載體pET28a-EGFP在E.coli BL21中的表達(dá)與檢測(cè)

盡管目的片段EGFP與表達(dá)載體pET28a得到了有效重組,但重組載體pET28a-EGFP是否能在原核系統(tǒng)中得到高效表達(dá)還需進(jìn)一步研究,因此通過(guò)利用pET28a-EGFP轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆,LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí),加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)12 h,取少量菌液涂片,在熒光顯微鏡(10×100)下可以明顯觀察到發(fā)綠光的單個(gè)細(xì)菌,將轉(zhuǎn)化成功的E.coliBL21命名為E.coliBL21-1,如圖3所示。而轉(zhuǎn)化菌劃線于含卡那霉素(50μg/mL)與IPTG(1 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,在自然光下菌落呈綠色如圖4所示,因此可以說(shuō)明,重組表達(dá)載體pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效的表達(dá),并且表達(dá)效果較好。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR插入檢驗(yàn)(左)和雙酶切鑒定(右)Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR amplification(left)and digesting with restriction enzymes(right)

圖3 E.coliBL21-1在藍(lán)光激發(fā)下(左)和在自然光下(右)觀察的結(jié)果Fig.3 Expression of EGFP inE.coliBL21-1 in the blue light(left)and in natural light(right)

圖4 E.coliBL21-1菌落在自然光下形態(tài)Fig.4 Colonies of E.coliBL21-1 in natural light

3 討 論

外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)常常對(duì)宿主造成很強(qiáng)的代謝負(fù)擔(dān),表達(dá)的目的蛋白有時(shí)會(huì)對(duì)宿主菌有“毒性”作用。而GFP恰恰克服了這一障礙,大部分研究認(rèn)為作為分子標(biāo)記物,GFP對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和細(xì)胞功能均無(wú)影響,無(wú)疑成為眾多科研人員的理想選擇。

本實(shí)驗(yàn)選擇的EGFP是野生型GFP的改造型,其所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP亮35倍,可以顯著提高其檢測(cè)的靈敏度;同時(shí)本研究中選擇pET28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體,該質(zhì)粒含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子,可以使目的基因得到高效表達(dá)。以上表明,pET28a-EGFP重組表達(dá)載體能使EGFP基因和pET28a質(zhì)粒充分發(fā)揮各自的優(yōu)良特性。若GFP直接作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,不僅可以克服熒光染料分布不均勻,易滲漏,隨細(xì)胞分裂被稀釋的缺點(diǎn)[9],也易于進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。

目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于GFP的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10-12],在食品科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究很少,國(guó)外有將GFP標(biāo)記食源性病原菌對(duì)其進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)的報(bào)道[13]。本實(shí)驗(yàn)將EGFP片段與pET28a載體連接,獲得重組質(zhì)粒pET28a-EGFP并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21工程菌中,GFP在自然光及熒光顯微鏡下均得到高效表達(dá),為以后標(biāo)記其他食源性病原菌并對(duì)其進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)提供了理論依據(jù)。

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