郭志華,牛術孟,金 紅

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室,遼寧沈陽 110001)

流行性感冒(簡稱流感)病毒是一種能引起急性呼吸道疾病的病毒,流感傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高,引起人和動物高的發(fā)病率和病死率[1],尤其是2009年發(fā)生的甲型H1N1流感再次引起全球關注[2-3]。目前,流感尚無特效治療方法,安全有效的疫苗是降低流感發(fā)病率和病死率,減少大規(guī)模流行的最重要的方法之一[4]。所有目前使用疫苗的共同特點之一是直接誘導針對病毒膜蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)產(chǎn)生中和抗體,達到預防同型流感病毒的目的。雖然這些疫苗的應用對人群起到保護作用,但是由于HA經(jīng)常發(fā)生抗原變異,此類疫苗不能防御變異株感染。到目前為止尚無有效的抗異型流感病毒感染疫苗。有研究人員已開始考慮通過提高適應性細胞免疫應答的方法,達到預防異型流感病毒感染的目的,但首先應弄清其防御機制,對此目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。本研究首先用一種流感病毒疫苗免疫小鼠,然后分別感染同型、異型流感病毒,研究異型病毒感染前后小鼠肺組織內(nèi)IFN-γ、 IL-2、 IL-4、 IL-10細胞因子水平變化,研究機體對異型流感病毒感染交叉免疫保護作用的機制,為制備能夠抵御不同型別流感病毒感染的疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡SPF級BALB/c小鼠,雌性,由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.1.2 病毒 A/FM/47(H1N1)流感病毒株,由中國醫(yī)科大學病原生物學實驗室提供,用前進行病毒滴定。

1.1.3 主要試劑 水合氯醛、PBS(中國醫(yī)科大學病原生物學教研室提供);H5N1流感病毒疫苗(哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司),重組鼠 IL-2(Pepro-Tech);細胞因子Elisa試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(香港力康發(fā)展有限公司,型號HF90);酶標儀(Inte rMed NJ-2100)。

1.2 方法

1.2.1 感染病毒滴度測定 將H1N1病毒儲存液用PBS溶液進行10倍等比稀釋(10-1～10-10),把各稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔中,每個稀釋度需要4枚雞胚,37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d,每天檢查雞胚生長情況,24 h內(nèi)死亡的雞胚,認為是非特異死亡應棄去。根據(jù)Reed-Muench方法,計算雞胚半數(shù)感染量(50%egg infectious dose,E ID50),E ID50為104.8。

1.2.2 動物分組 取上述小鼠50只,隨機分為實驗組和對照組,實驗1組(異型免疫組):用H5N1免疫,H1N1感染;實驗2組(異型免疫加強組):用H5N1免疫, IL-2加強免疫,H1N1感染;對照1組(同型免疫組):用H1N1免疫,H1N1感染;對照2組(病毒感染對照組):用PBS緩沖液免疫,H1N1感染;對照3組(空白對照組):正常飼養(yǎng),不做任何處置。各組標記后分別稱重,正常飲水食物喂養(yǎng),每日觀察記錄小鼠的活動狀態(tài)及臨床表現(xiàn)、稱量體重。

1.2.3 免疫動物 將各組小鼠用水合氯醛輕度麻醉,選用H5N1、H1N1疫苗或PBS液按上述分組免疫動物,疫苗接種按說明書進行,每只小鼠鼻腔接種50μL。首次免疫3周后加強免疫1次,方法劑量同上,加強免疫的同時根據(jù)文獻[5]及試劑說明書,實驗2組小鼠分別經(jīng)腹腔注射活性為5×107U/mg重組鼠 IL-2 1 mL,濃度為160 U/mL。

1.2.4 感染動物 加強免疫2周后,各組小鼠用水合氯醛輕度麻醉,按上述分組每只小鼠經(jīng)鼻腔感染E ID50為104.8的H1N1流感病毒100μL,正常飲食飲水飼養(yǎng),感染病毒后每天準確稱量小鼠體重,觀察飲食飲水及精神狀態(tài)。

1.2.5 存活率和肺指數(shù) 小鼠感染流感病毒后觀察其存活情況,記錄每組死亡數(shù),計算各組存活率(感染后各組小鼠存活數(shù)目/感染前各組小鼠總數(shù)×100%);無菌解剖取小鼠全肺稱重,并計算肺指數(shù)(肺臟濕重/小鼠體重×100%)。

1.2.6 細胞因子測定 分別于感染前、感染7 d后無菌解剖取小鼠全肺(每組3只),按常規(guī)方法制作肺組織勻漿,4℃離心機,3 000 r/min,離心10 min,取上清分裝,做好標記,-20℃保存待測。EL ISA試劑盒測定感染前后細胞因子 IL-2、IL-4、 IL-10、IFN-γ含量,具體操作按試劑盒說明書進行,酶標儀測OD450值,保存結(jié)果,計算細胞因子含量(pg/mL)。

1.2.7 統(tǒng)計學方法處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉχ±S)表示,用t檢驗進行兩兩比較,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況及肺指數(shù)

如圖1、圖2所示,實驗1組(異型免疫組)感染H1N1病毒后存活率為30%～50%,體重較感染前下降,至第7天降低17.34%;實驗2組(異型免疫加強組)感染病毒6 d后存活率為85.71%,至第7天體重下降15.16%;2組小鼠體溫降低,食欲欠佳,精神狀態(tài)差;對照1組(同型免疫組)全部存活,體重基本無變化;對照2組(病毒感染對照組)小鼠感染病毒1 d后全部死亡。肺指數(shù)值越大,表示肺重量增加,肺炎性病變程度嚴重;實驗1組(異型免疫組)肺指數(shù)最大為3.29%,實驗2組(異型免疫加強組)次之為2.53%,其余各組均差異不大(圖3)。結(jié)果表明,經(jīng)同型疫苗免疫的小鼠能抵抗同型流感病毒的感染,產(chǎn)生完全保護作用;對異型流感病毒感染可產(chǎn)生一定的交叉免疫保護作用,免疫增強劑可能起到增強疫苗效果的作用。

圖1 小鼠感染流感病毒后的存活率Fig.1 Survival rates of the mice after influenza virus challenge

圖2 小鼠感染流感病毒后的體重變化Fig.2 Bodyweight of the mice after influenza virus challenge

2.2 Elisa試劑盒檢測細胞因子

細胞因子IFN-γ、 IL-2、 IL-4、 IL-10含量測定結(jié)果如下(圖4～7,表1、表2)。實驗1組(異型免疫組)和實驗2組(異型免疫加強組)感染病毒后細胞因子IFN-γ、 IL-10含量明顯高于感染前(P<0.05);感染病毒后實驗1組(異型免疫組)IFN-γ、 IL-10含量高于對照1組(同型免疫組)(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。

圖3 小鼠感染流感病毒前后肺指數(shù)Fig.3 The lung index of the mice before and after influenza virus challenge

圖4 EL ISA測定細胞因子IFN-γ的濃度值(pg/mL)Fig.4 The concentration of cytokines IFN-γassayed by EL ISA(pg/mL)

圖5 EL ISA測定細胞因子I L-2的濃度值(pg/mL)Fig.5 The concentration of cytokines IL-2 assayed by EL ISA(pg/mL)

圖6 EL ISA測定細胞因子 IL-4的濃度值(pg/mL)Fig.6 The concentration of cytokines IL-4 assayed by EL ISA(pg/mL)

圖7 EL ISA測定細胞因子 IL-10的濃度值(pg/mL)Fig.7 The concentration of cytokines IL-10 assayed by EL ISA(pg/mL)

3 討 論

流感病毒特異性抗體,往往由流感病毒表面蛋白HA抗原刺激產(chǎn)生,特異性強,不能中和異型流感病毒;通過提高細胞免疫的方法,達到預防異型流感病毒感染的目的,已開始受到研究者廣泛關注。目前認為抗流感病毒細胞免疫應答反應,是以流感病毒共有蛋白NP為主要抗原[6]。Boon等[7]認為細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應在抗異型流感病毒感染中起重要作用。而Nguyen等[8]認為記憶性B淋巴細胞與流感病毒異型間交叉保護免疫反應密切相關。Droebner等[9]則認為CD4+淋巴細胞介導了這種交叉免疫作用。亦有學者[10]通過一些手段提高宿主抵抗異型流感病毒的能力。但目前有限的報道尚無統(tǒng)一結(jié)論。研究適應性細胞免疫應答反應在抗異型流感病毒感染方面的主要機制,是開發(fā)以細胞免疫機制為基礎的抵抗異型流感病毒感染疫苗的前提,此類疫苗可以為機體提供交叉免疫保護。

感染流感病毒后,可刺激機體產(chǎn)生多種細胞因子,小鼠CD4+輔助性T淋巴細胞(helper T cell,Th細胞)可分為Th1和Th2型細胞。Th1細胞主要分泌IFN-γ、 IL-2等細胞因子,這些細胞因子多介導細胞免疫;Th2細胞主要分泌 IL-4、 IL-10等細胞因子,這些細胞因子則介導體液免疫。

本研究首先用流感病毒疫苗免疫小鼠,然后分別感染同型、異型流感病毒,從感染病毒后小鼠的一般情況及肺指數(shù)看,實驗1組(異型免疫組)小鼠用H5N1疫苗免疫,H1N1病毒感染6 d后存活率為33.33%,第7天體重下降17.34%,肺指數(shù)為3.29%,細胞因子IFN-γ、 IL-10含量感染病毒后明顯高于感染前(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。實驗2組(異型免疫加強組)小鼠用H5N1疫苗免疫,同時使用免疫增強劑 IL-2后感染H1N1病毒6 d后存活率為85.71%,至第7天體重下降15.16%,肺指數(shù)為2.53%,細胞因子IFN-γ、I

L-10含量感染病毒后明顯高于感染前(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。對照1組(同型免疫組)小鼠用H1N1疫苗免疫,H1N1病毒感染后全部存活。結(jié)果表明,如果小鼠感染與疫苗同一型別的流感病毒,則可得到完全保護;而如果感染與疫苗不同型流感病毒,感染小鼠部分生存,說明異型流感病毒間存在部分交叉免疫。另一結(jié)論為,應用免疫增強劑的應用,可以提高這種交叉免疫作用。免疫增強劑 IL-2是通過怎樣的機制對小鼠起到交叉保護作用,須進一步研究確定。關于各種細胞因子的檢測結(jié)果,尤為突出的是異型免疫組和異型免疫加強組病毒感染后細胞因子IFN-γ含量明顯高于感染前,說明此細胞因子可能在流感病毒異型間交叉保護免疫反應中起重要作用。在小鼠感染模型中發(fā)現(xiàn),CD4+和CD8+T細胞在控制流感病毒感染中的作用至關重要[11]。IFN-γ屬于Th1類細胞因子,主要參與細胞免疫反應。記憶性CD8+T細胞以表達IFN-γ為主[12],Seo等[13]證實記憶性CD8+T細胞是高致病性流感病毒交叉免疫保護作用的關鍵因素,而這種交叉免疫保護作用與肺組織中表達IFN-γ的記憶性CD8+T細胞的含量有關。在異型流感病毒感染后IFN-γ水平升高的確切機制有待深入研究。本研究還發(fā)現(xiàn)感染異型病毒后小鼠肺組織中IL-10含量亦升高, IL-10雖然屬于Th2類細胞因子,但可介導炎性反應,研究表明[14], IL-10作為一種重要的抗炎性細胞因子,能廣泛抑制促炎介質(zhì)生成,防止促炎反應失控。

表1 EL ISA測定細胞因子IFN-γ、I L-2的濃度值(ˉχ±S,pg/mL)Table 1 The concentration of cytokines IFN-γand IL-2 assayed by EL ISA(mean±s,pg/mL)

表2 EL ISA測定細胞因子I L-4、I L-10的濃度值(ˉχ±S,pg/mL)Table 2 The concentration of cytokines IL-4 and I L-10 assayed by EL ISA(mean±s,pg/mL)

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