張楠楠, 潘衛(wèi)東, 崔玉琳, 秦 松, 薛樂勛

(1. 鄭州大學 生物工程系 細胞生物學研究室, 河南 鄭州 450001; 2. 鄭州大學基礎醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室, 河南 鄭州 450001; 3. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 4. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

杜氏鹽藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和分析

張楠楠1, 潘衛(wèi)東2, 崔玉琳3, 秦 松4, 薛樂勛1

(1. 鄭州大學 生物工程系 細胞生物學研究室, 河南 鄭州 450001; 2. 鄭州大學基礎醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室, 河南 鄭州 450001; 3. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 4. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

為研究杜氏鹽藻(Dunaliella salina)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因的功能, 根據萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)等真核生物PEPC基因高度保守序列, 設計一對簡并引物, 通過RT-PCR的方法獲得杜氏鹽藻PEPC基因部分序列, 然后采用 RACE的方法分別克隆到5′端和3′端序列, 拼接后得到全長cDNA, 其長度為3 523bp, 包含2 949 bp的完整開放閱讀框, 編碼982個氨基酸, 相對分子質量為110 560.5。氨基酸序列與已知物種PEPC序列的同源性依次為：Chlamydomonas reinhardtii69%,Chlorella variabilis55%,Ostreococcus tauri50%和Ostreococcus lucimarinusCCE9901 49%, 表明所克隆的序列確為杜氏鹽藻PEPC cDNA序列。

杜氏鹽藻(Dunaliella salina); 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 基因克隆; 序列分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸不可逆反應生成磷酸和草酰乙酸, 是光合作用關鍵酶[1-2], 存在于所有光合生物中, 同時還參與氨基酸代謝中碳骨架回補作用[3]。20世紀80年代末, 日本學者杉木[4]博士發(fā)現大豆籽粒蛋白質含量與 PEPC活性密切相關, 受此啟發(fā), 陳錦清等[5]提出“底物競爭”假說, 認為籽粒的主要儲藏物質油脂、蛋白質均來自葡萄糖酵解產物-丙酮酸, 兩者之間存在著底物競爭, 底物競爭的平衡點取決于 PEPC和乙酰輔酶 A羧化酶(ACCase)的相對活性。PEPC催化丙酮酸合成草酰乙酸進入蛋白質代謝; 乙酰輔酶 A羧化酶催化丙酮酸合成乙酰輔酶A進入脂肪代謝。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶控制油脂和蛋白質生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向, 從而決定蛋白質/油脂含量比例[6]。

杜氏鹽藻(Dunaliella salina)是一種抗逆性很強的單細胞真核綠藻, 能在0.05～5 mol/L的鹽水中生長、繁殖[7]。杜氏鹽藻的突出優(yōu)點在于培養(yǎng)條件簡單、光合自養(yǎng)、抗逆性極佳[8], 可以大規(guī)模開放式培養(yǎng),極大地降低培養(yǎng)成本, 因此適合作為高油脂工程藻株。作者通過比較一些已知物種PEPC的cDNA序列, 設計簡并引物, 以杜氏鹽藻的cDNA為模板, 通過 RT-PCR的方法從杜氏鹽藻中克隆出 PEPC的cDNA片段, 并利用RACE技術首次從杜氏鹽藻中克隆了包含 PEPC基因完整編碼區(qū)的 cDNA, 通過BLAST和DNAMAN對該序列分析得到PEPC基因及蛋白的相關信息, 為進一步通過抑制PEPC基因的表達提高杜氏鹽藻的油脂含量打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 藻株與菌株

杜氏鹽藻(Dunaliella salina, UTEX-LB-1644)購自美國德州大學(The University of Texas, USA), 大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑 TRIzol購自 Invitrogen公司;AMV第一鏈cDNA 合成試劑盒, 3′-Full RACE Core Set和5′-Full RACE Set均購自上海生工生物工程有限公司; Taq DNA聚合酶和pMD18-T載體均購自寶生物(大連)生物工程有限公司(TaKaRa); 凝膠回收試劑盒和質粒DNA提取試劑盒購自杭州維特潔生物公司。

1.3 杜氏鹽藻的培養(yǎng)

杜氏鹽藻細胞按照5×105個/mL的接種量接種在PKS液體培養(yǎng)基中[9], 26℃光照培養(yǎng), 光照強度為4 500 lx, 明暗周期各12 h。

1.4 簡并引物的設計

根據 GenBank上已登錄的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)等真核生物PEPC基因的cDNA序列進行比對分析, 找到兩段簡并程度較低的引物序列, 正向引物 5′-TGGATGGG(C/T)GG-(C/A/T)GA(C/T)CG-3′;反向引物：5′-CC(C/G/A)CC-(C/G/A)GT(G/A)TT(C/G)TGCAT-3′, 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 杜氏鹽藻總RNA的提取

取對數生長期的杜氏鹽藻細胞, 用 TRIzol試劑提取總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性, 通過測定A260/A280判斷RNA的濃度和純度。

1.6 PEPC基因cDNA片段的擴增

以提取的鹽藻總RNA為模板, 根據AMV第一鏈 cDNA 合成試劑盒的說明, 用 AMV反轉錄酶合成 cDNA第一鏈, 以此為模板, 用合成的簡并引物,進行RT-PCR擴增PEPC基因的cDNA片段。反應程序為, 94℃預變性5 min; 94℃ 45 s, 55℃ 30 s, 72℃130 s, 30個循環(huán); 72℃延伸10 min, 4℃終止。反應結束后, PCR反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 杜氏鹽藻 PEPC基因 cDNA片段的測序

RT-PCR產物經凝膠回收試劑盒回收后, 連接到pMD18-T載體上, 轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α, 用含有 Amp、X-gal和IPTG的LB平板進行篩選, 挑取陽性菌落, 用pMD18-T載體兩端引物做菌液PCR進行鑒定。感受態(tài)細菌的制備、連接、質粒DNA的提取、菌液PCR鑒定等, 參見分子克隆實驗指南(第二版)[10]。含有目的片段的陽性克隆由上海生工生物工程有限公司測序。

1.8 PEPC基因的3′RACE擴增

根據簡并引物擴增得到的已知序列, 分別設計PEPC 的 3′RACE 上游外側引物：5′-GGCGACAAAGGCTACAC-3′和上游內側引物：5′-GACCCGAGCAAAGACCC-3′, 提取杜氏鹽藻的總 RNA, 按照3′-Full RACE Core Set說明進行操作。巢式 PCR 反應產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對目的片段進行膠回收后連接于 pMD18-T載體上, 轉化大腸桿菌DH5α, 挑取陽性菌落, 菌液PCR鑒定正確后由上海生工生物工程有限公司測序。

1.9 PEPC基因的5′RACE擴增和序列分析

根據擴增得到的已知序列, 分別設計 PEPC的5′RACE下游外側引物：5′-CCAGAAGTCGGCGTAGTTGC-3′和下游內側引物：5′-GATAGCATGGAAG TAGGCAT TCACA-3′,提 取 杜 氏 鹽 藻 的 總RNA, 按照 5′-Full RACE Set說明進行操作。巢式PCR 反應產物經連接、轉化和測序, 序列通過Primer Premier 5.0整理拼接全長, 與GenBank上其他物種的PEPC序列進行序列比對, 用BLAST進行同源性分析, 并用ORF Finder進行在線分析開放閱讀框以及DNAMAN軟件分析得到PEPC基因及蛋白的相關信息。

2 結果

2.1 杜氏鹽藻總RNA的提取結果

提取的杜氏鹽藻總 RNA, 經瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質量及完整性均較好。提取的杜氏鹽藻總RNA 28 S和18 S 2條帶清楚,A260/A280的比值為 1.8～2.0, 提示無蛋白和基因組 DNA污染, 完全適合下一步的RT-PCR反應。

2.2 RT-PCR擴增的杜氏鹽藻 PEPC基因cDNA片段

以cDNA為模板, 利用簡并引物進行PCR擴增,約2 000 bp處可見較弱的擴增條帶, 與預期目的片段大小一致 (圖1)。將產物連接到pMD18-T載體上,經過轉化篩選, 菌液 PCR檢測, 可以清晰地看到條帶(圖2)。

2.3 杜氏鹽藻 PEPC 基因 3′和 5′序列的擴增

經過巢式 PCR, 得到 3′片段長度約為 600 bp(圖3), 5′片段長度約為1 000 bp(圖4), 膠回收后連接于pMD18-T載體上, 經過轉化篩選測序, 3′RACE獲得序列長度為541 bp, 5′RACE獲得序列長度為1 032 bp。

圖1 杜氏鹽藻PEPC基因cDNA片段Fig. 1 PEPC cDNA fragment from Dunaliella salina

圖2 含鹽藻PEPC序列的重組質粒的菌液PCR擴增Fig. 2 Amplification of PEPC cDNA from pMD-PEPC by Bacteria Liquid PCR

2.4 杜氏鹽藻PEPC基因序列分析

根據所獲得的中間片段、3′端和5′端序列拼接出杜氏鹽藻 PEPC基因的全長 cDNA序列。該基因cDNA序列全長3 523 bp, 包含2 949 bp的完整開放閱讀框, 編碼 982個氨基酸, 另外 5′非編碼區(qū)(5′-UTR)序列長 138 bp, 3′非編碼區(qū)(3′-UTR)序列長436 bp。BLAST結果顯示獲得PEPC氨基酸序列具有已知 PEPC相似的 Ppc結構域(圖5)。通過DNAMAN軟件對該序列分析得到PEPC蛋白的相關信息, 其蛋白質的相對分子質量為110560.5, 等電點為 6.94, 其中含量較高的氨基酸是 Leu(11.97%),Arg(9.24%), Glu(7.46%), Val(6.12%); 跨膜結構分析表明該蛋白不包含跨膜結構域; pH7時, 蛋白質電荷為－0.81, 推測該蛋白可能是的水溶性蛋白。

圖3 巢式PCR擴增杜氏鹽藻PEPC基因3′下游序列Fig. 3 Amplification of the 3′ downstream sequence of Dunaliella salina PEPC gene by nested PCR

圖4 巢式PCR擴增杜氏鹽藻PEPC基因5′上游序列Fig. 4 Amplification of the 5′upstream sequence of Dunaliella salina PEPC gene by nested PCR

圖5 杜氏鹽藻PEPC推測的功能結構域Fig. 5 Putative functional domains of PEPC from Dunaliella salina

2.5 杜氏鹽藻PEPC基因的同源性分析

將推導杜氏鹽藻PEPC的982個氨基酸與已知物種PEPC 序列進行同源性分析(圖6)。結果依次為：Chlamydomonas reinhardtii69%,Chlorella variabilis55%,Ostreococcus tauri50%和Ostreococcus lucimarinusCCE9901 49%。

3 討論

簡并引物是一類由多種寡核苷酸組成的混合物,彼此之間有一個或數個核苷酸的差異。通過簡并引物進行 PCR, 可以相對簡便的檢測一個已知基因家族的新成員, 或用來檢測物種間的同源基因[11]。而RACE 方法可從低豐度的轉錄本中高效獲得目的基因全長序列及包含完整編碼區(qū)的基因片段, 目前應用十分廣泛[12]。通過比較物種間 cDNA保守序列設計簡并引物, 用 PCR的方法篩選同類基因, 并通過RACE 方法獲得 5′端和 3′端序列, 不失為一種獲得目的基因全長序列簡單可靠的方法。本實驗利用上述方法從杜氏鹽藻中首次獲得了 PEPC基因全長3 523 bp, 包含2 949 bp的完整開放閱讀框, 編碼982個氨基酸。通過BLAST和DNAMAN分析, 獲知了杜氏鹽藻PEPC基因及蛋白的部分信息, 為微藻PEPC基因的結構和特性研究提供了參考。

杜氏鹽藻是一種抗逆性很強的單細胞真核綠藻,培養(yǎng)條件簡單, 光合自養(yǎng)生長, 可以大規(guī)模開放式培養(yǎng)[7-8], 極大地降低培養(yǎng)成本, 適合作為高油脂工程藻株的材料。PEPC控制磷酸烯醇式丙酮酸的流向,決定蛋白質/油脂含量比例[6], 因而在油脂代謝中起關鍵作用。目前利用 RNAi技術證明了反義抑制PEPC基因的表達能夠提高油菜種子的油脂含量[5]。本實驗獲得了杜氏鹽藻 PEPC基因完整的編碼區(qū)序列, 對下一步轉基因載體的構建及蛋白表達的研究具有指導作用, 也為進一步通過抑制PEPC基因的表達提高杜氏鹽藻的油脂含量打下了基礎。

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Cloning and analysis of phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) gene ofDunaliella salina

ZHANG Nan-nan1, PAN Wei-dong2, CUI Yu-lin3, QIN Song4, XUE Le-xun1

(1. Laboratory for Cell Biology, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China;2. Department of Immunology and Microbiology, College of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University,Zhengzhou 450001, China; 3. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;4. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China)

Dec., 25, 2010

Dunaliella salina; PEPC; gene cloning; sequence analysis

To investigate the function of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) gene ofDunaliella salina, a pair of degenerate primers was designed according to the conserved motifs of the PEPC ofChlamydomonas reinhardtii,Arabidopsis thaliana, andArachis hypogaea. A cDNA fragment was obtained from green algaDunaliella salinathrough RT-PCR, and then the full length of the cDNA was isolated by 3’ and 5’RACE. The isolated cDNA sequence was 3523 bp in length with a 2949 bp coding region that encoded 982 amino acid residues with the predicted relative molecular mass of 110560.5 dolton. In addition, homology analysis showed that PEPC ofD. salinawas highly similar to that ofC. reinhardtii(69%),Chlorella variabilis(55%),Ostreococcus tauri(50%), andO.lucimarinusCCE9901(49%), suggesting that the cDNA isolated fromDunaliella salinawas PEPC-encoding.

Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2011)12-0042-06

2010-12-25;

2011-04-12

張楠楠(1986-), 男, 河南洛陽人, 碩士研究生, 研究方向為基因工程, 電話：0371-66658328, E-mail：cellbiology68@sohu.com; 秦松, 通信作者, E-mail：sqin@yic.ac.cn; 薛樂勛, 通信作者, E-mail：xuelx@zzu.edu.cn

梁德海)