陳淑吟,徐士霞,張志勇,郭忠仁,孫中響,3,朱立靜,3

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通226007; 2.南京師范大學 生命科學院 動物遺傳資源研究所,江蘇 南京,210097; 3.蘇州大學 醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院,江蘇 蘇州 215123)

大黃魚(Pseudosciaena croceaRichardson 1846)隸屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena),主要分布于中國黃海南部、東海和南海,為暖溫性近海集群洄游魚類,一般體長20～40 cm,最大可達75 cm,曾是中國傳統(tǒng)的“四大海魚”之一。20世紀 70年代以前,大黃魚具有明顯的漁場和漁汛期[1]。由于酷漁濫捕和環(huán)境污染,大黃魚自然資源幾近枯竭,到80年代以后形不成漁汛。漁業(yè)部門雖然制訂了許多資源保護措施,但至今大黃魚仍屬東海區(qū)資源嚴重衰退的種類[2]。20世紀80年代末劉家富等[3]研究成功人工繁育大黃魚,現(xiàn)在大黃魚人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化規(guī)模在福建、浙江等地不斷壯大,但伴隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展又面臨著大黃魚品質(zhì)下降、病害頻發(fā)的局面,進行科學管理對保護和恢復大黃魚資源相當必要[4]。近幾年來,開展的人工放流大黃魚對恢復幾近枯竭的自然資源具有積極意義,而對現(xiàn)有遺傳資源的了解有助于進一步保護該資源的遺傳多樣性。

中國黃海南部的呂泗漁場為大黃魚主要自然分布區(qū)之一,目前大黃魚自然資源也十分稀少,有關(guān)該海區(qū)大黃魚的種質(zhì)狀況及其與其他群體的遺傳差異未有報道; 而且,該海區(qū)是目前尚未開發(fā)人工養(yǎng)殖的大黃魚主要分布海域。線粒體COI基因序列作為功能穩(wěn)定又具較多變異的序列,作為分子標記已被應用于許多水生生物種群遺傳學研究中,但目前尚未見用于大黃魚的群體遺傳學研究。作者利用線粒體COI基因序列片段與ISSR標記方法研究大黃魚江蘇呂泗漁場自然群體的遺傳多樣性,并比較其與浙江、福建主產(chǎn)區(qū)兩個養(yǎng)殖群體間遺傳差異,為大黃魚資源保護與利用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與總基因組DNA提取

大黃魚 3個群體樣本取樣時間在 2009年 9～10月。江蘇野生群體樣本(JS,30個)于呂泗漁場海區(qū)為3次捕撈得到,體長22.2～24.8 cm; 兩個養(yǎng)殖群體樣本分別來自浙江象山港(ZJ,30個)和福建寧德(FJ,30個)養(yǎng)殖海區(qū),體長分別為 8.2～9.2 cm、20.3～21.6 cm。

基因組總 DNA提取采用 DNA提取試劑盒(Takara,DV811A),按試劑盒說明書要求操作,最后洗脫定溶于TE(100 mg/L)溶液中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 COI引物設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)魚類COI通用引物[5]以及從NCBI數(shù)據(jù)庫下載大黃魚的COI序列,設(shè)計擴增COI基因序列引物,序列為：COI-F：5’ -TCT ACT AAT CAC AAA GAC ATC GGC AC-3’ /COI-R：5’-GAC CTC AGG ATG GCC GAA GAA TCA-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

PCR反應總體積為50 μL,含有：DNA模板約50 ng,濃度為10 pmol引物各1 μL,25 μLPremix ExTaq聚合酶混合液(Takara,Code：D332A)。PCR擴增參數(shù)為：94℃預處理 5 min; 進行 35 循環(huán)：94℃ 30 s,55℃30 s,72℃ 1 min; 最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)染色,凝膠成像系統(tǒng)檢測。產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(BBI,Code：BS364)切膠純化后送上海Sangon用PCR反應引物雙向測序。測序儀器為ABI PRISM 3730,測序試劑為BigDye terminator v3.1。

1.3 COI序列數(shù)據(jù)分析

所得DNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源檢測確認; 利用 ClustalX1.81[6]軟件進行序列比對及波形圖譜校正。用MEGA4.0軟件[7]統(tǒng)計序列的核苷酸組成、多態(tài)性位點及構(gòu)建基于 Kimura’s 2-parameter模型 (Kimura,1980)的鄰接法(Neighborjoining,NJ)與非加權(quán)分組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)系統(tǒng)樹(bootstrap重復1000 次)。用DNAsp 4.0軟件[8]計算單倍型數(shù)量(Number of haplotypes,Nh)、單倍型多態(tài)性(Haplotype diversity,簡稱Hd)、平均核苷酸差異(Average number of differences,簡稱K)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,簡稱Pi),應用 Nei(1973)基因多樣度法計算遺傳分化系數(shù)(Gst)及基因流(Nm)等。

1.4 ISSR引物篩選與PCR擴增

引物為加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的第9套 ISSR引物序列,由上海生工合成。每個群體各選取3個DNA模板在15 μL的反應體系中進行擴增篩選,從初選的48個引物中進一步篩選10個擴增條帶清晰、重復性好的引物(表2)進行分析。

PCR 反應總體積為 25 μL,引物 0.5 mmol/L,DNA 模板約 20 ng,12.5 μLPremix ExTaq 聚合酶混合液(Takara)。PCR擴增參數(shù)為：94 ℃預變性5 min后進入36個循環(huán)：94℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃ 2 min;最后72℃延伸10 min。

1.5 ISSR擴增的電泳檢測及數(shù)據(jù)分析

PCR 擴增產(chǎn)物在 minicell EC350 電泳儀上進行檢測,電泳緩沖液為 0.5×TBE,瓊脂糖凝膠濃度為 1.5%(含 0.5 μg/mL EB),電壓不超過 5 V/cm,電泳2～3 h后取出,于 BIO- RAD 紫外成像儀下拍照記錄。

按照電泳圖譜中同一位置上DNA帶的有無進行統(tǒng)計,有帶記為“1”,無帶記為“0”,記錄清晰、穩(wěn)定且長度在200～2000 bp范圍內(nèi)的擴增帶,將圖譜轉(zhuǎn)化為 0/1矩陣。應用 Popgene1.31[9]軟件在假定種群處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下,應用 Nei (1987)分析群體遺傳參數(shù)方法,分別計算多態(tài)位點百分率(PPL)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間的遺傳分化系數(shù)(Gst),并根據(jù)Nei’s遺傳距離,對群體進行UPGMA樹聚類分析。

以Gst估算基因流：Nm=0.5(1 -Gst)/Gst[10]

2 結(jié)果

2.1 不同群體 COI 基因片段擴增結(jié)果與序列分析

大黃魚mt DNA基因COI片段的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果為單一條帶,長度約 700bp,空白對照沒有出現(xiàn)擴增產(chǎn)物。序列經(jīng)比對后得到片段長度為625 bp,經(jīng) NCBI數(shù)據(jù)庫相似性檢測確認為大黃魚COI基因序列。測序成功65個序列,分別為：JS群體28個、ZJ群體19及FJ群體18個。

序列共檢測到18個多態(tài)位點,其中11個為簡約信息位點,無插入或缺失位點,轉(zhuǎn)換與顛換比值為4.089,序列的堿基組成T、C、A及G的平均含量分別為27.7%、30.7%、22.4%及19.2%,A+T含量(50.1%)與G+C相當。共有15個單倍型,單倍型多態(tài)性(Hd)為0.714,不同單倍型多態(tài)位點分布見圖1。JS野生群體28個樣本中有9個群體獨享單倍型,占群體14個單倍型的64.28%,這些單倍型沒有共同變異位點;ZJ群體獨享單倍型1個(h5),占群體單倍型的9.09%;FJ群體沒有獨享單倍型; 3群體間共享 3個單倍型(h1、h4及h11),其中單倍型h1擁有最多個體數(shù),分別為來自JS群體8個、ZJ群體10個及FJ群體的16個樣本; 另外,有 2個單倍型(h2及 h13)為 ZJ與 JS兩群體共享。從表1幾項指標中表明JS群體具有最高的遺傳多樣性,FJ群體的遺傳多樣性明顯偏低。序列單倍型GenBank的登錄號為：FJ851334- FJ851355和 GQ864238-GQ864250。

表1 基于COI部分序列的大黃魚3個群體的遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of the three populations of P.crocea based on mtDNA COI sequences

圖1 基于 COI部分序列的不同單倍型的變異位點分布(“.”代表相同位點)Fig.1 Different sites among 15 haplotypes of mtDNA COI sequences (The “.” reprents the same site)

群體間的遺傳分化估算值(Genetic differentiation estimates,P-value)為 0.9854(P＞0.05,nt significant),且群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)小于0(-0.00333),表明群體間沒有明顯遺傳分化; 另外,依據(jù)Nei(1973)計算得出群體間Gst=0.05318,基因流為NmCOI=4.45。從兩兩群體間Gst反映出3個群體間的親緣關(guān)系,JS與FJ、FJ與ZJ及ZJ與JS群體的Gst分別為 0.02115、-0.0125及-0.0196,即 JS與 FJ群體的親緣關(guān)系最遠,ZJ與JS群體的親緣關(guān)系最近。由15個單倍型構(gòu)建NJ與UPGMA系統(tǒng)樹中拓樸結(jié)構(gòu)相似,3個群體的多數(shù)單倍型并列在一起,見圖2。

2.2 ISSR標記的引物篩選與擴增結(jié)果

從100個引物中最終篩選出10個擴增效果較好的引物,見表 2,其中有 4個引物為雙堿基重復類型。這些引物擴增所得條帶數(shù)多在 8～18,分子量在200～2000 bp范圍內(nèi)。3個群體大部分引物擴增的多態(tài)性差別較大。有 2個引物擴增得出電泳圖譜在不同群體的條帶分布明顯不同,如引物 873擴增出 FJ群體在200～300 bp處及400～500 bp處各有3條及1條不同于其他兩群體的特異性條帶(圖3); 在圖4中,引物895擴增圖譜在500～600 bp處有2條帶的可以確定樣品來自ZJ群體。利用引物擴增上存在的這些差異條帶,可以進行不同種群樣本的鑒定。

圖2 大黃魚3個群體COI單倍型的NJ與UPGMA法聚類樹(節(jié)點上數(shù)字為大于50%置信度)Fig.2 NJ and UPGMA phylogenetic tree based on mt COI gene sequences across 15 haplogypes of P.crocea.(Numbers represent bootstrap percentages that above 50%)

通過 Nei’s(1987)分子進化分析,群體內(nèi)的基因多樣性(Hs)為 0.2494,群體總的基因多樣性(Ht)為0.3131,群體內(nèi)的基因多樣性所占比率(Hs/Ht)為0.7965,即群體的變異大部分來自群內(nèi),群間遺傳差異不大。對3個群體進行UPGMA聚類分析表明JS群體與ZJ群體系統(tǒng)親緣關(guān)系較近(表3,圖5)。

3 討論

3.1 大黃魚群體遺傳多樣性與種質(zhì)保護

DNA序列的單倍型多樣性(Hd)是衡量一個群體遺傳變異程度的重要指標,Hd高表明群體具有較高的遺傳多樣性。本研究表明,江蘇野生群體具有豐富得多的遺傳多樣性(Hd=0.9150),而浙江養(yǎng)殖群體又比福建養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性水平,HdZJ=0.6830＞HdFJ=0.3235; 人工養(yǎng)殖群體由于親本個體數(shù)少及近親雜交等因素,不可避免地喪失某些特定的等位基因,造成其遺傳變異度及遺傳多樣性水平均低于野生種群的狀況[11-13]。養(yǎng)殖群體原有親本的進化潛力也對其后代遺傳多樣性高低有直接影響,本研究得出浙江象山養(yǎng)殖群體表現(xiàn)有較高于福建寧德養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,這可能與福建人工養(yǎng)殖親本更早人工馴化繁育、遺傳進化潛力水平偏低相關(guān)。陳錦等[14]利用同工酶技術(shù)分析得出湄洲的野生群體遺傳多樣性較寧德的野生群體高,而寧德野生和養(yǎng)殖群體及連江養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平幾乎一致; 這可能由于人工放流和養(yǎng)殖逃逸的影響,致使野生群體和養(yǎng)殖群體間存在很大的基因交流,而當?shù)睾^(qū)野生數(shù)量稀少也加劇了這種影響。由于自然資源的稀少,除了加強對捕撈的管理,開展大黃魚人工放流是增加、恢復其資源量的有效方法。

表2 大黃魚ISSR引物及群體多態(tài)性Tab.2 ISSR primers sequences and the diversity of P.crocea

圖3 引物873對3個群體的擴增電泳Fig.3 PCR resulte of primer 873 in three populations

圖4 引物895對3個群體的擴增電泳Fig.4 PCR resulte of primer 895 in three populations

表3 大黃魚不同群體的遺傳一致度(上)及遺傳距離(下)Tab.3 Nei's genetic identity (upper diagonal) and genetic distance (lower diagonal) among populations of P.crocea

圖5 基于ISSR的大黃魚3個群體UPGMA聚類Fig.5 UPGMA dendrogram for three populations of P.crocea based on ISSR analysis

大黃魚的集群洄游生活習性使其具有較廣的擴散和分布范圍。田明誠等[15]曾依據(jù)形態(tài)特征和地理分布把中國沿海的大黃魚分為主要 3個地理群體：岱衢群(分布于黃海南部至東海中部)、閩-粵東群(分布于東海南部、臺灣海峽和南海北部)及粵西群(分布于珠江口以西至瓊州海峽的南海區(qū))。目前這些海區(qū)的大黃魚自然資源已非常罕見,瓶頸效應和基因漸滲使得該物種的群體遺傳多樣性越來越低。雖然,人工養(yǎng)殖后代會丟失一些親本遺傳信息,本研究中野生群體與養(yǎng)殖群體具有很高的遺傳一致度,該結(jié)果與田明誠等[15]有關(guān)不同海區(qū)大黃魚地理群體區(qū)分相一致。依據(jù)mtCOI基因序列的得出3個群體間的親緣關(guān)系由遠及近為：FJ與JS＞FJ與ZJ＞ZJ與JS群體。由ISSR的系統(tǒng)聚類樹也得到與群體分布的地理距離相一致的結(jié)果。兩種標記研究結(jié)果均表明群體間基因流均大于 1(NmCOI為 7.02,NmISSR為1.9563),Wright[16]認為群體間Nm＞1能發(fā)揮均質(zhì)化作用,從而有效抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化。

3.2 不同標記方法的大黃魚群體遺傳學研究

分子遺傳標記在魚類種質(zhì)資源保護與應用研究領(lǐng)域正發(fā)揮著越來越重要作用。RAPD、AFLP及SSR標記均被用于分析、揭示大黃魚群體遺傳多樣性[12,17-18]。作者利用mtCOI基因序列揭示的大黃魚這 3個群體的遺傳特性,與利用電泳圖譜分析的ISSR技術(shù)得到的結(jié)果基本一致。mtCOI基因序列與ISSR這兩種標記在本文研究結(jié)果中的相同點主要為：(1)群體間的Nm皆大于 1,表明群體間存在明顯的基因交流,群體間的地理距離對基因交流有一定影響;(2)JS群體具最豐富遺傳多樣性,且與ZJ群體親緣關(guān)系更近,系統(tǒng)關(guān)系皆與地理分布距離相一致。兩標記方法又有各自的不同點：(1)ISSR是以條帶的擴增情況來反映結(jié)果,不但DNA模板質(zhì)量及條帶統(tǒng)計對結(jié)果估算有一定影響,而且需要較多的引物擴增、得出較多的統(tǒng)計數(shù)據(jù)才能更為真實的反映群體間的差異狀況; 但方法簡單,用于種群鑒定上有其優(yōu)勢,作者利用2個ISSR引物便可以簡單把不同群體樣品區(qū)分出來; (2)COI基因序列標記直接反映種群的DNA遺傳信息,可以準確得出各群體的遺傳多樣性水平、群體間的系統(tǒng)分化、遺傳差異程度,并已作為動物DNA條形碼應用于物種鑒定[19],結(jié)果比 ISSR的更清晰; 但9個JS群體單倍型沒有具有可以作為區(qū)分群體的特異位點。利用COI基因序列及ISSR兩種標記比用單一方法反映出更為確切的群體之間的遺傳進化關(guān)系。作者的這些研究結(jié)果為大黃魚的種質(zhì)保護與利用研究提供了進一步的依據(jù)。

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