晁 敏,王云龍,沈新強(qiáng)

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋和河口漁業(yè)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)

近年建在河口或沿海地區(qū)的濱海電廠不斷增加,電廠運(yùn)營在保障海岸帶地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí),其冷卻水系統(tǒng)的取排水對(duì)海區(qū)生態(tài)環(huán)境和資源生物也帶來了較大的負(fù)面影響[1],比較直觀的影響為急性熱沖擊和卷載效應(yīng)[2-4],而經(jīng)冷卻系統(tǒng)加溫的海水排入海域后同樣具有環(huán)境效應(yīng)[5-6],據(jù)研究,電機(jī)容量為1800～2000MW 機(jī)組的溫排水可使出水口水溫升高8～12℃,而為防止污損生物對(duì)冷卻系統(tǒng)的阻塞,氯制劑廣泛應(yīng)用于電廠冷卻水系統(tǒng),導(dǎo)致排水口氯的殘留濃度可達(dá) 0.1～0.2 mg/L[7],有時(shí)可達(dá) 0.42～1.0 mg/L[8],因此電廠溫排水同時(shí)具有溫度升高和余氯殘留兩個(gè)特點(diǎn)。

從20世紀(jì)50年代以來,國外研究者就對(duì)海水中殘留余氯的生態(tài)效應(yīng)開展了大量研究[9-12],中國自80年代以來也開展了相關(guān)影響研究[13-15]。國際上已有余氯標(biāo)準(zhǔn)頒布,如美國 EPA水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定水中總余氯的標(biāo)準(zhǔn)限值為 0.01 mg/L,而歐洲標(biāo)準(zhǔn)更低,為0.005 mg/L,國內(nèi)尹伊偉[14]早在1992年就曾撰文推薦0.01 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)限值,然而至今中國還未制訂溫排水中余氯排放限值標(biāo)準(zhǔn)。

魚類在胚胎發(fā)育及仔魚期容易受到水溫[16-17]及污染物[18-20]的影響,而中國目前關(guān)于水溫和余氯雙因素對(duì)海水魚類胚胎發(fā)育和仔魚期影響的研究還較少[21],本研究以黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)(舊稱黑鯛(Sparus macrocephalus))的前期仔魚為對(duì)象,分析溫度、余氯及兩種因子交互作用對(duì)仔魚存活率的影響,黑棘鯛具有適溫適鹽性廣、食譜雜、抗病能力較強(qiáng)、生長迅速等生理和生態(tài)特點(diǎn),在中國東南沿海屬經(jīng)濟(jì)魚種,因此是一種比較理想的試驗(yàn)動(dòng)物[22],本研究可望為中國將來制訂沿海電廠溫排水溫度和殘留余氯濃度限值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在江蘇省海洋水產(chǎn)研究所啟東海水增養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)用海水取自基地,經(jīng)0.45 μm醋酸纖維素濾膜過濾,煮沸、曝氣24 h后備用。取安替福民即次氯酸鈉(分析純)配制余氯母液,由于該母液中氯屬游離態(tài)氯,在光作用下易于降解,需避光保存。

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)水溫條件：18、22,26、30℃,其中18℃為室溫條件下水溫,后 3個(gè)水溫條件由水浴控溫; 每個(gè)水溫條件下設(shè) 0.025、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L總計(jì)6個(gè)余氯濃度水平,并以過濾海水為試驗(yàn)對(duì)照,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)組。試驗(yàn)開始前各組預(yù)先調(diào)節(jié)好水溫,加入余氯母液。

以剛孵化出1 d的黑棘鯛前期仔魚為試驗(yàn)生物,用吸管挑取前期仔魚20～30只置于已調(diào)節(jié)好水溫、余氯濃度的400 mL燒杯內(nèi),并計(jì)仔魚放入的時(shí)刻為0,于24、48、72、96 h用解剖鏡觀察仔魚存活狀態(tài),當(dāng)仔魚心臟停止跳動(dòng)時(shí)判定為死亡,試驗(yàn)期間投喂輪蟲為仔魚的開口餌料。

由于中國電廠冷卻系統(tǒng)加氯方法通常采取周期性連續(xù)加氯或每天加氯1 h的方式[23],電廠溫排水中余氯濃度并不是恒定不變的,而且余氯受光照、溫度等因素影響在短短幾小時(shí)內(nèi)可衰減至極低水平,因此為模擬電廠溫排水中余氯分布特征,試驗(yàn)期間各組試驗(yàn)液每12 h全部更換,每次海水經(jīng)水溫預(yù)調(diào)、加氯,再將仔魚轉(zhuǎn)移至新的燒杯中。

1.2 數(shù)據(jù)處理方法

分別計(jì)算24、48、72、96 h仔魚存活率,對(duì)仔魚存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,處理方法如下：

其中Ps為黑棘鯛仔魚標(biāo)準(zhǔn)化死亡率(以100計(jì)),P為各組黑棘鯛仔魚存活率(以100計(jì))。

余氯對(duì)黑棘鯛仔魚半致死余氯濃度(LC50)計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[24],采用下式在 Statistica6.0軟件中對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合：

其中x為余氯濃度,T、W兩個(gè)參數(shù)由迭代得到,其中T為LC50或EC50,W代表曲線的曲率因?yàn)椋?/p>

當(dāng)Ps為50時(shí),x=T。

采用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件比較各組死亡率是否具有顯著性差異分析,當(dāng)方差齊時(shí),采用多重比較方差分析方法(LSD),當(dāng)P＜ 0.05時(shí)統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異意義,當(dāng)方差不齊時(shí),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排秩處理,采用SPSS中廣義線性模型(Generalized linear model,GLM)的多元方差分析中的 SNK (Student-newman-kuels)方法[25],當(dāng)P＜ 0.05時(shí)統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異意義。

采用廣義相加模型[26](Generalized additive model,GAM)研究仔魚死亡率與溫度、余氯、曝露時(shí)間的關(guān)系,模型表達(dá)形式如下：

其中：g為仔魚死亡率的連接函數(shù),S為光滑函數(shù),一般采用 3次樣條函數(shù)[27-28],其中S1為水溫的光滑函數(shù),S2為余氯的光滑函數(shù),S3為曝露時(shí)間的光滑函數(shù),error為隨機(jī)誤差。

仔魚死亡數(shù)據(jù)為二元屬性數(shù)據(jù),因此死亡率可采用邏輯連接函數(shù)表示,其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

因此廣義相加模型可寫為：

其中,error為隨機(jī)誤差。

然而,為更有效地分析各因素間的交互作用,在SPSS中采用雙因素方差分析方法進(jìn)行研究,當(dāng)P＜ 0.05時(shí)表明對(duì)死亡率具有顯著性影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溫對(duì)對(duì)照組初孵黑棘鯛仔魚的影響

用于試驗(yàn)的仔魚剛孵化出1 d,仍處于前期仔魚階段,卵黃囊尚未消失,仔魚為內(nèi)源營養(yǎng)期。6 h時(shí),各組沒有仔魚死亡,其中,18℃組、22℃組仔魚可靈活游動(dòng),26℃組的仔魚則沉于燒杯底部,但對(duì)接觸反應(yīng)靈敏,而 30℃組仔魚的背鰭基部出現(xiàn)隆起,發(fā)育速度明顯高于其他組,但已有部分仔魚出現(xiàn)尾部彎曲,且對(duì)接觸沒有反應(yīng),表明運(yùn)動(dòng)受到抑制。24 h時(shí),18℃組、22℃組、26℃組沒有仔魚出現(xiàn)死亡,其中,18℃組、22℃組的尾鰭、消化道已形成,26℃組除尾鰭、消化道形成外,部分仔魚已開口,而30℃組全部仔魚運(yùn)動(dòng)受到抑制,有 23.4%的仔魚死亡。48 h時(shí),只有18℃組未出現(xiàn)仔魚死亡,22℃組、26℃組、30℃組出現(xiàn)了不同程度的死亡情況,死亡率分別為2.9%、1.3%、98%,30℃組仔魚死亡率增加明顯。72 h時(shí),各組仔魚均有死亡,死亡率分別為0.8%、2.9%、7.7%、98%。96 h時(shí),各組死亡率分別為1.6%、7.0%、7.7%、98%,22℃組、26℃組仔魚死亡率沒有變化,表明該實(shí)驗(yàn)組仔魚的生長和發(fā)育已非常適應(yīng)試驗(yàn)水溫條件(表 1)。

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析,18℃組、22℃組、26℃組 3組仔魚死亡率沒有顯著差別(P＞0.05),且死亡率均低于10%,可認(rèn)為這3個(gè)水溫條件對(duì)仔魚死亡不存在顯著性影響,而 30℃水溫則對(duì)仔魚死亡具有顯著性影響(P＜ 0.05)。

每種生物對(duì)水溫均有一定的耐受范圍,仔魚的耐熱性往往低于幼魚或成魚,曾江寧[29]的研究表明,初孵 1周的黑棘鯛仔魚 24 h的半數(shù)致死水溫為30.3℃,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近,24 h時(shí)30℃水溫造成的初孵仔魚死亡率為23.4%。

表1 對(duì)照組黑棘鯛仔魚不同水溫條件下的死亡率Tab.1 The lethal rate of Acanthopagrus schlegelii larvae in control group at different water temperature

2.2 余氯對(duì)初孵黑棘鯛仔魚的影響

高濃度余氯可在短時(shí)間內(nèi)造成仔魚死亡,仔魚體形一般為 S形扭曲,或尾部斷裂、甚至蜷縮成球狀。由表2可知,0.8 mg/L的余氯在24 h時(shí)對(duì)仔魚的死亡率與對(duì)照組具有顯著性差異(P＜0.05),隨著曝露時(shí)間的延長,低濃度余氯對(duì)仔魚的死亡率開始與對(duì)照組顯現(xiàn)出差異,水溫越高,余氯致毒濃度愈低,如26℃組在48 h時(shí)0.05 mg/L的余氯對(duì)仔魚的死亡率與對(duì)照組具有顯著性差異。

采用公式 1對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到余氯對(duì)仔魚的半致死效應(yīng)濃度LC50值,列于表3。大多數(shù)生物在溫度升高時(shí)表現(xiàn)出對(duì)更低劑量的余氯敏感,如大型溞(Daphnia magna)、白鰱(Hypophthalmichthys molitrix)[14],虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、美洲原銀漢魚(Menidia beryllina)[30],銀鮭(Oncorhynchus kisutch)、胡瓜魚(Osmerus mordax)、斑尾美洲(Notropis hudsonius)[31]等,黑棘鯛仔魚也不例外,從表 3總數(shù)據(jù)可明顯看出,余氯對(duì)黑棘鯛仔魚的 LC50值顯著受到了水溫的協(xié)同影響,當(dāng)水溫達(dá)到 30℃時(shí),水溫則成為仔魚主要死亡因素。

表2 各余氯濃度組仔魚死亡率與對(duì)照組仔魚死亡率差異性檢驗(yàn)Tab.2 Significance test of mortality rate of Acanthopagrus schlegelii larvae between rc (residual chlorine) and control group

表3 各水溫條件下余氯對(duì)仔魚的LC50值(mg/L)Tab.3 Lethal concentration of residual chlorine to the larvae of Acanthopagrus schlegelii at different temperature

2.3 黑棘鯛初孵仔魚死亡率與水溫、余氯、暴露時(shí)間關(guān)系

采用 GAM 模型研究仔魚死亡率與水溫、余氯、暴露時(shí)間的關(guān)系,建立 GAM 模型連接函數(shù)所需數(shù)據(jù)見表4,對(duì)response數(shù)據(jù),以二元數(shù)據(jù)賦值,對(duì)仔魚未死亡賦值 0,其對(duì)應(yīng)余氯的值選擇余氯對(duì)仔魚無觀測影響濃度(None observed effect concentration,簡稱NOEC),即與對(duì)照無顯著性差異的余氯濃度,見表 2;對(duì)50%死亡的仔魚賦值0.5,其對(duì)應(yīng)余氯的值為LC50。

表4 GAM模型連接函數(shù)所需數(shù)據(jù)Tab.4 Data for link function of GAM

圖1 仔魚死亡率與水溫、余氯、曝露時(shí)間的光滑函數(shù)擬合結(jié)果Fig.1 GAM plots for temperature,residual chlorine and exposure time

GAM分析結(jié)果(表5)顯示,仔魚死亡率與水溫、余氯含量、曝露時(shí)間并不存在 3次或更復(fù)雜分段樣曲線關(guān)系(Pr ＞ 0.05),而是近似的分段線性關(guān)系,見圖1-1,各因子的光滑函數(shù)隨對(duì)應(yīng)因子的變化曲線也具有此特點(diǎn),從圖1-2可看出,水溫在18～26℃間與S(水溫,4)間具有線性關(guān)系,從圖1-3可看出,余氯在0.025～0.4 mg/L 與S(余氯,4)間具有近似線性關(guān)系,從圖1-4可看出,96 h曝露時(shí)間內(nèi)時(shí)間與仔魚死亡率具有近似線性關(guān)系。各因子的光滑函數(shù)隨對(duì)應(yīng)因子的變化曲線可進(jìn)一步解釋仔魚死亡率隨因子變化的關(guān)系,當(dāng)光滑函數(shù)值高于0時(shí),所對(duì)應(yīng)的因子值即對(duì)仔魚產(chǎn)生明顯致死效應(yīng)的數(shù)值,從圖1-2看出,水溫為 26℃時(shí),S(水溫,4)開始大于 0,水溫由 26℃升至30℃時(shí),S(水溫,4)急劇上升,表明水溫高于 26℃對(duì)黑棘鯛初孵仔魚的致死效應(yīng)明顯,從圖 1-3可看出,余氯濃度高于 0.2 mg/L時(shí),開始對(duì)仔魚具有明顯的致死效應(yīng),從圖 1-4可看出,在有余氯存在情況下,曝露時(shí)間超過 48 h,會(huì)對(duì)黑棘鯛初孵仔魚產(chǎn)生明顯致死效應(yīng)。

經(jīng)多元方差分析結(jié)果可知(表 6),水溫、余氯、曝露時(shí)間對(duì)仔魚死亡率具有顯著性影響(P＜ 0.05),水溫-余氯、水溫-曝露時(shí)間之間具有顯著性交互作用(P＜0.05),從圖 2-1和圖 2-2存在線段相交的情況也可說明交互作用的存在,其中,水溫和余氯的交互作用主要發(fā)生在低濃度余氯組,余氯和曝露時(shí)間的交互作用主要發(fā)生在24 h和48 h; 而水溫與曝露時(shí)間之間沒有顯著的交互作用(P=0.989＞0.05),從圖2-3可看出沒有線段相交的情況。

與多種化學(xué)因子如重金屬Cu[32]、Cd[33]、農(nóng)藥[34]與水溫具有交互作用一樣,余氯與水溫之間也具有交互作用,且一般為協(xié)同作用[32],而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,當(dāng)水溫高于 30℃或余氯濃度高于 0.8 mg/L時(shí),水溫和余氯間均可成為仔魚死亡主導(dǎo)因素,二者間的交互作用很難被觀測到。

曝露時(shí)間與污染物的毒性間通常具有顯著的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)中,仔魚死亡率與曝露時(shí)間之間呈線性關(guān)系,隨著曝露時(shí)間的延長,余氯的LC50值逐漸減少,與Hall等[35]研究結(jié)論相似。

表5 廣義相加模型擬合結(jié)果Tab.5 Fitted results of GAM

表6 雙因素方差分析受試者間效應(yīng)結(jié)果Tab.6 Results of tests between subjects effects of univariate analysis

圖2 各因子間交互作用Fig.2 The plot of interaction between factors

3 結(jié)論

18、22、26℃ 3種水溫對(duì)黑棘鯛初孵仔魚致死率均低于 10%,與對(duì)照組相比不存在顯著性差異,30℃水溫對(duì)仔魚死亡率與對(duì)照相比具有顯著差異(P＜ 0.05),24 h時(shí)初孵仔魚死亡率 23.4%,48 h時(shí)為98%。

24 h時(shí)18、22、26、30℃ 4種水溫條件下余氯對(duì)黑棘鯛仔魚的的 LC50值分別為 0.816、0.460、0.433、0.319 mg/L,可見水溫升高會(huì)增強(qiáng)余氯對(duì)仔魚的致死效應(yīng),而隨著時(shí)間延長,余氯對(duì)仔魚的 LC50效應(yīng)濃度值進(jìn)一步降低,至96 h,其值分別為0.242、0.211、0.140、＜0.025 mg/L。

GAM分析結(jié)果顯示,水溫在18～26℃間與仔魚死亡率間具有線性關(guān)系,水溫由 26℃升至 30℃時(shí),仔魚死亡率有急劇上升,表明水溫高于 26℃對(duì)黑棘鯛初孵仔魚致死效應(yīng)明顯; 余氯在 0.025～0.4 mg/L與仔魚死亡率間具有近似線性關(guān)系,當(dāng)余氯濃度高于0.2 mg/L時(shí),對(duì)仔魚致死效應(yīng)明顯; 96 h內(nèi)曝露時(shí)間與仔魚死亡率具有近似線性關(guān)系,在有余氯存在情況下,曝露時(shí)間超過 48 h,會(huì)對(duì)黑棘鯛初孵仔魚產(chǎn)生明顯致死效應(yīng)。

經(jīng)多元方差分析結(jié)果可知,水溫、余氯、曝露時(shí)間對(duì)仔魚死亡率具有顯著性影響(P＜0.05),水溫-余氯、水溫-曝露時(shí)間之間具有顯著性交互作用(P＜0.05)。

致謝：本次實(shí)驗(yàn)得到了江蘇省海洋水產(chǎn)研究所啟東海水增養(yǎng)殖基地的大力支持,同時(shí)也得到了東海水產(chǎn)研究所蔣玫副研究員、黃世林、馬繼臻同學(xué)的大力幫助,謹(jǐn)此表示感謝。

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