曹晉忠,魏磊,蘇紅,范黎＊ ,李玉＊

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所,長春 130118;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

＊印度塊菌粗多糖的提取及抗氧化活性研究

曹晉忠1,魏磊2,蘇紅2,范黎2＊,李玉1＊

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所,長春 130118;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

采用正交試驗研究了熱水浸提法提取印度塊菌(Tuber indicumCooke&Massee)子實體粗多糖(TICP)的最優(yōu)工藝,根據(jù)方差分析結(jié)果確定了熱水浸提法的最優(yōu)工藝為:料液比1∶15,提取時間120 min,提取溫度100℃,提取2次,多糖提取率為6.790 2%.用95%乙醇對粗多糖進(jìn)行醇沉,然后利用總抗氧化能力(T-AOC)測定法、羥基自由基(OH·)清除法、鐵離子螯合能力及測定還原能力等方法對上述印度塊菌粗多糖的抗氧化活性進(jìn)行評價,結(jié)果顯示塊菌粗多糖對羥基自由基的清除活性最高,其EC50值為0.26 mg/mL,其次為還原能力和鐵離子螯合能力,其EC50值分別為1.15 mg/mL、2.80 mg/mL,同時塊菌粗多糖具有較好的總抗氧化能力(T-AOC),當(dāng)濃度為20 mg/mL時,其總抗氧化能力為72.06 U/mL.

印度塊菌;多糖;抗氧化

塊菌(Tuber)屬于珍稀食、藥用真菌,在我國主要分布于云南和四川.塊菌除本身味美外,且營養(yǎng)豐富,并含有多種生物活性物質(zhì).如α-雄烷醇能調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期,神經(jīng)酰胺作為一種天然的人體皮膚保濕成分可用于化妝品的開發(fā),塊菌多糖具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的作用[1].機體在正常生物代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)等,進(jìn)而導(dǎo)致機體脂質(zhì)過氧化,對脂類、蛋白質(zhì)、核酸造成損害[2],引發(fā)機體衰老以及癌癥、動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[3].研究發(fā)現(xiàn),許多食用菌都具有各種生理活性,如抗癌、抗氧化、抗炎以及產(chǎn)生抗生素等[4],其中抗氧化活性可能與菌體的多糖含量有關(guān).本研究對印度塊菌(Tuber indicumCooke&Massee)粗多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行了研究,并測定其體外抗氧化活性,以期為塊菌多糖的研究、開發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

凍干、成熟的印度塊菌.新鮮的印度塊菌購自云南當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場,由首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院范黎老師鑒定.

1.2 主要試劑和儀器

Ferrozine、VC等購自Sigma公司;羥基自由基測定試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒等購自南京建成生物工程研究所;EDTA二鈉鹽、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、乙醇、甲醇、葡萄糖、冰乙酸、濃硫酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等購自北京化工廠.所有試劑均為分析純.

紫外分光光度計(Lambda 35,Perkin Elmer),冷凍干燥儀(Wizard 2.0,VirTis),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heizbad HB digit,Heidolph),臺式高速離心機(Lab way Science Rotina 35),恒溫水浴鍋(HW.SY21-K4型,北京長風(fēng)儀器儀表公司),鼓風(fēng)干燥箱(ZRD-A 7140型,上海智城分析儀器制造有限公司),循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B95型,河南鞏義市英峪予華儀器廠).

1.3 印度塊菌多糖的提取及測定

稱取凍干后的塊菌子實體20 g,粉碎至100目,加15倍蒸餾水,于100℃浸提120 min.抽濾,將濾渣加入第1次水量的80%,同樣條件再浸提1次,抽濾后合并兩次濾液,真空濃縮后加入3倍體積的95%的乙醇過夜醇沉,70℃烘干后得到塊菌粗多糖(Tuber indicumcrude polysaccharide,TICP).采用苯酚-硫酸法[5]測定樣品中多糖含量.將干燥的待測粗多糖定容至100 m L,準(zhǔn)確吸取1 m L該溶液定容至100 m L,取0.6 m L稀釋液加入蒸餾水1.4 mL、苯酚液1 mL、濃硫酸5 m L.振蕩,沸水浴10 min,迅速冷卻,然后在490 nm波長下比色,所得的儀器讀數(shù)即為樣品中多糖含量.多糖提取率(%)=多糖含量(g)/原料干重(g)×100%.

1.4 印度塊菌粗多糖的熱水浸提工藝

1.4.1 料液比單因素優(yōu)化

在 90 ℃,分別按照料水(蒸餾水)1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25水浴煮提 1 h,煮提兩次 ,第 2次水量為第1次的80%,每次煮提后均進(jìn)行抽濾,濾液旋蒸濃縮后進(jìn)行醇沉,70℃烘干復(fù)溶后測多糖含量(下同).

1.4.2 提取時間單因素優(yōu)化

按照料液比為1∶10,在90 ℃水浴分別提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min,測定多糖含量.

1.4.3 煮提溫度單因素優(yōu)化

按照料水比為1∶10,分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴提取1 h,測定多糖含量.

1.4.4 p H單因素優(yōu)化

在90℃,料液比為1∶15水浴提取1 h,第2次水量為第1次的80%.p H值分別調(diào)節(jié)為4.14、5.64、7.14、8.64、10.14,測定多糖含量.

1.4.5 正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以料液比、提取時間、提取溫度等為3因素,各取3個水平,并考慮各因素間的交互作用,按L18(37)進(jìn)行正交實驗,以確定其最佳提取工藝條件.

1.5 印度塊菌粗多糖抗氧化活性的測定

1.5.1 羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力和總抗氧化能力(T-AOC)的測定

上述實驗均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定,其中總抗氧化能力(T-AOC)定義為在37℃時,每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位/U.

1.5.2 還原能力測定

還原能力(將Fe3+還原為Fe2+)測定參照 Yen&Chen的方法[6].OD值越高,說明反應(yīng)物的還原性越強,每個樣品平行測3次,取其平均值.用VC作為陽性對照.

1.5.3 鐵離子螯合能力測定

鐵離子(Fe2+)螯合能力測定參照Decker&Welch的方法[7].每個樣品平行測定3次,取平均值.以蒸餾水作為空白對照,EDTA二鈉鹽作為陽性對照.根據(jù)下面公式計算塊菌多糖提取物的鐵離子螯合能力:

其中A0為空白對照的OD值,A1為加有樣品或者陽性對照后的OD值.

1.5.4 EC50值

EC50值指清除率為50%時所需樣品的濃度,是評價塊菌提取物抗氧化活性的重要參數(shù).上述1.5.1、1.5.3中各試驗的EC50值分別指當(dāng)羥基自由基清除率和當(dāng)鐵離子螯合率為50%時的樣品濃度,而1.2.5.2還原力測定的試驗中其EC50值是指在700 nm處OD值為0.5時塊菌粗多糖的濃度.EC50值的計算應(yīng)用中值效應(yīng)分析通過軟件Calcusyn 1.0(Biosoft)完成.

2 結(jié)果與分析

2.1 印度塊菌粗多糖(TICP)的熱水浸提工藝

2.1.1 單因素試驗

試驗結(jié)果(圖1,P139)表明,提取粗多糖的最佳料液比為1∶15(圖1,a);最佳提取時間為120 m in(圖1,b);粗多糖的提取率隨著提取溫度的升高而增大,考慮到實驗條件限制和能源節(jié)約等實際問題沒有嘗試高于100℃的溫度,故最佳提取溫度為100℃(圖1,c);在酸性(p H=4.14)和中性偏堿性(p H=7.14)條件下多糖的提取率較高,蒸餾水(p H=5.64,弱酸性)對多糖的提取率相對稍低(圖1,d).鑒于不同的酸堿度,尤其是過酸或過堿時會影響多糖的結(jié)構(gòu),故選擇p H為蒸餾水自然p H時的提取條件進(jìn)行正交優(yōu)化.選取的正交優(yōu)化因素為:料液比、提取時間、提取溫度.

圖1 印度塊菌粗多糖提取的單因素試驗Fig.1 Effect of different factors on extraction yield of Tuber indicum crude polysaccharide

表1 正交試驗結(jié)果Table 1 Results of experiment by orthogonal design

表2 方差分析表Table 2 ANOVA for the results of experiment by orthogonal design

2.1.2 正交試驗

由正交試驗方差分析表(表2)可知,料液比、提取時間、提取溫度等3個因素之間相互作用的F值小于臨界值,所以這3個因素之間無交互作用.影響塊菌多糖提取率的因素大小依次為A(料液比)＞B(時間)＞C(溫度),其中料液比的F值為3.697,大于臨界值(3.110),所以在α=0.1的條件下,料液比為顯著影響因素.由直觀分析表(表1)可知,塊菌多糖提取的最佳組合為A 2B3C2,即料液比為1∶15;溫度為100℃;提取時間為120 m in,最終多糖的提取率為6.790 2%.這與單因素實驗的結(jié)果相一致.

2.2 印度塊菌粗多糖(TICP)的抗氧化能力測定

2.2.1 總抗氧化能力(T-AOC)的測定

試驗結(jié)果(圖2)表明,隨著塊菌粗多糖濃度的升高,其所對應(yīng)的總抗氧化能力也呈線性增長.濃度為20 mg/m L的粗多糖總抗氧化能力達(dá)到72.06 U/m L,但明顯小于相同濃度下VC的總抗氧化能力(157.18 U/mL).

2.2.2 羥基自由基清除能力測定

結(jié)果(圖3)表明,濃度為0.2～10 mg/m L的塊菌粗多糖對OH·的清除率隨其濃度的增加而增加,濃度為10 mg/mL的粗多糖溶液對OH·的清除率達(dá)到96.89%,明顯接近于相同濃度下的VC溶液對OH·的清除率(99.80%).EC50值計算結(jié)果也表明,塊菌粗多糖對羥基自由基有很強的清除活性,其 EC50值為0.26 m g/m L,而 VC的 EC50值為 0.23 mg/m L.

圖2 印度塊菌粗多糖(TICP)總抗氧化能力(T-AOC)的測定Fig.2 Total antioxidative capacity of crude polysaccharides from Tuber indicum(TICP)

圖3 印度塊菌粗多糖(TICP)羥基自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activities of crude polysaccharides from Tuber indicum(TICP)

2.2.3 還原能力測定

本試驗的研究結(jié)果(P141圖4)表明,塊菌粗多糖的還原力低于VC,并呈現(xiàn)出劑量依賴性.通過計算,粗多糖的EC50值為1.15 mg/mL.雖然20 mg/mL塊菌粗多糖的還原力(OD值為2.767)比5 mg/m L的VC溶液(OD值為2.900)還要略低一些,但已表明塊菌粗多糖具較好的還原力.

2.2.4 鐵離子螯合能力測定

本試驗的結(jié)果(P141圖5)表明,隨著樣品濃度的增加,塊菌粗多糖的鐵離子螯合能力也隨之增加.濃度為10 mg/m L的塊菌粗多糖溶液對鐵離子的螯合能力達(dá)到了96.94%,而EDTA的螯合能力在1 mg/m L時就幾乎達(dá)到了100%.通過計算,粗多糖的 EC50值(2.80 m g/m L)也要高于 EDTA(0.20 mg/m L).綜上所述,塊菌粗多糖對鐵離子的螯合能力雖然與EDTA有一定的差距,但是仍表現(xiàn)出良好的活性.

圖4 印度塊菌粗多糖(TICP)還原能力的測定Fig.4 Reducing power of crude polysaccharides from Tuber indicum(TICP)

圖5 印度塊菌粗多糖(TICP)鐵離子螯合能力測定Fig.5 Chelating ferrous ion capacity of crude polysaccharides from Tuber indicum(TICP)

3 討論

多糖類物質(zhì)在食用菌中普遍存在,食用菌多糖作為保健食品和藥品已經(jīng)逐漸為人們所認(rèn)識,尤其在生物活性方面很受重視[8].大量研究發(fā)現(xiàn),許多食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的活性,起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用[9].

印度塊菌多糖水溶液的濃度為1 mg/m L時其總抗氧化能力為20.84 U/m L,低于0.85 mg/m L的黃傘菌(Pholiota ad iposa(Batsch)P.Kumm.)菌絲體多糖(35.2 U/m L)[10],而10 mg/mL塊菌的粗多糖水溶液的總抗氧化能力為35.03 U/mL,高于相同濃度的榛蘑(Arm illariella mellea(Vahl)P.Kumm.)(13 mg/m L)[11].10 mg/m L塊菌的粗多糖水溶液對OH·的清除率達(dá)到了96.89%,其EC50值為0.26 mg/m L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金頂側(cè)耳(Pleurotus citrinopileatusSinger)(2.45 mg/m L)、姬菇(P.cornucopiae(Paulet)Rolland)(2.60 mg/mL)、毛頭鬼傘(Coprinus com atus(O.F.Müll.)Pers.)(2.59mg/mL)[12]和松衫靈芝(Ganoderm a tsugaeMurrill)子實體(＞20 mg/mL)[13],顯示了較好的羥基自由基清除能力,這意味著印度塊菌粗多糖能有效地阻止羥基自由基對人體的氧化損傷.印度塊菌粗多糖表現(xiàn)出較好的還原能力,1mg/m L時的還原力在700 nm下OD值為0.42 A,高于姬松茸(Agaricus blazei M urrill)多糖(0.12 A)[14],略高于雙孢菇(Agaricus bisporus(J.E.Lange)Imbach)(0.41 A)[15]和樹舌(Ganoderm a applanatum(Pers.)Pat.)胞內(nèi)多糖(0.38 A)[16].在0.2 mg/mL時的還原力(0.23 A)與相同濃度的杏鮑菇(P.eryngii(DC.)Quél.)胞內(nèi)多糖(0.25 A)[17]相當(dāng);其EC50值為1.15 mg/m L,低于松衫靈芝子實體(8.09 mg/mL)[13].1 mg/mL的雙孢菇粗多糖鐵離子的鰲合力接近85%[15],2 mg/m L的姬松茸為40.1%[14],印度塊菌粗多糖雖然在低濃度下不及上述兩種食用菌,但在20 mg/mL時達(dá)到了96.94%,顯示出了良好的Fe2+的螯合能力,其 EC50值為2.80 mg/m L,低于松衫靈芝 (3.32 mg/m L)[13].

綜上可知,印度塊菌水溶性多糖有較好的自由基清除和鐵離子螯合能力,具有良好的抗氧化活性.EC50值是評價真菌提取物抗氧化活性強弱的重要參數(shù),通常當(dāng)EC50值低于10 mg/m L,表明真菌提取物具有很好的抗氧化活性[18].本課題研究的印度塊菌粗多糖在所檢測的抗氧化試驗中均表現(xiàn)出良好的活性,表明印度塊菌的多糖對人體的氧化損傷有一定的保護(hù)作用.對于印度塊菌多糖的抗氧化作用機制以及抗氧化活性物質(zhì)還有待于進(jìn)一步的研究.

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Study on Extraction and Anti-oxidan t Activity of Crude Polysaccharides from Tuber indicum

CAO Jin-zhong1,WEILei2,SU Hong2,FAN Li2,LI Yu1
(1.Institute of Mycology,Jilin Agricultural University,Changchun130118,China;
2.College of Life Science,Capital Normal University,Beijing100048,China)

With orthogonal design,the optimal conditions for extraction of crude polysaccharide from fruitbodies ofTuber indicumwere studied by hot water.Based on the result from ANOVA,the optimal conditions of hot water extraction method w ere as follow s:the material and liquid in the ratio of 1 to 15,for 120 min of extraction duration,at 100℃and extraction for 2 times.The extraction rate of polysaccharide was 6.790 2%under this condition.After ethanol precipitation with 95%ethanol,the antioxidant activity of above-mentioned crude polysaccharide was evaluated by fourmethods,including determining total antioxidative capacity(T-AOC),scavenging hydroxyl free radical(OH·),determining chelating and reducing capacity of ferrous ion.The result showed that the crude polysaccharide fromT.indicumpossessed the most potent capacity fo r scavenging hydroxyl free radical(OH·)w ith EC50values reaching 0.261 m g/m L,followed by the capacity for reducing and chelating ferrous ion w ith EC50values reaching 1.15 mg/mL and 2.80 mg/mL.Meanw hile,the crude polysaccharide fromT.indicumhad good total anti-oxidative capacity,w hen the concentration was 20 mg/mL,its total antioxidative capacity was 72.06 U/m L.

Tuber indium;polysaccharide;extraction;antioxidation

Q949.91;S646

A

0253-2395(2011)01-0137-06＊

2010-05-11;

2010-08-30

國家自然科學(xué)基金(30770005;30870008)

曹晉忠(1963-),男,山西太原人,博士研究生,從事菌物分類學(xué)及菌物次生代謝產(chǎn)物研究.通訊作者:E-mail:fanli@mail.cnu.edu.cn;yuli966@126.com