張君，徐文靜，奚海林，王勇，陸環(huán)，謝建新

（新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子830002）

敗血癥通常由感染引發(fā)，主要的病理特征是：內(nèi)毒素和其他病原體刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白介素－1（IL－1）等，過多的炎癥因子會引發(fā)全身系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，繼而出現(xiàn)組織損傷，最終引起致命的多臟器功能衰竭［1－5］。盡管在最近幾年，敗血癥的治療取得了突破性的進(jìn)展，尤其是相應(yīng)炎癥因子抗體的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用，但敗血癥仍然保持著較高的致死率［6－7］。

最近的研究結(jié)果提示，在敗血癥的病理演進(jìn)過程中，有一些較遲表達(dá)的下游炎癥因子起著重要的作用。高遷移率蛋白－1（high mobility group box－1，HMGB－1）為新近發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)LPS所致遲發(fā)死亡的細(xì)胞因子，是細(xì)胞內(nèi)的一種DNA結(jié)合蛋白，由被激活的巨噬細(xì)胞作為一種前炎癥因子釋放至細(xì)胞外部。其產(chǎn)生較TNF－α和IL－1β等早期細(xì)胞因子晚，且持續(xù)時間較長，故有"膿毒癥的晚期介質(zhì)"之稱。最新研究表明，丙酮酸鹽能夠下調(diào)許多前炎癥因子基因的表達(dá)，如一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），TNFα，IL－6等［8－9］，并且丙酮酸鹽可以抑制巨噬細(xì)胞對HMGB1的釋放［10－11］。

本研究在建立敗血癥實(shí)驗(yàn)動物模型基礎(chǔ)上，系統(tǒng)檢測敗血癥大鼠血漿中各主要炎癥因子（TNFα、IL－6等）及晚期炎癥因子HMGB1水平時序變化，探討應(yīng)用丙酮酸鹽在不同劑量、不同時間點(diǎn)對敗血癥的治療效果（對各種炎癥因子影響、敗血癥大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕媛实挠绊懀?/p>

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物

Wistar健康雄性大鼠，體重260～300g，購買自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，微生物控制等級為清潔級。

1．2 模型建立

大鼠在室溫24℃左右適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。采用乙醚吸入式麻醉，盲腸結(jié)扎穿孔法建立敗血癥大鼠模型。大鼠模型的建立、給藥、炎癥因子的檢測以及藥效的評價均采用雙盲法。

1．3 分組

1．3．1 對照組

選取造模成功的大鼠24只，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組作為對照，每組8只，假手術(shù)組8只，共4組。

（1）假手術(shù)組：麻醉后只進(jìn)行開腹手術(shù)，未進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔。

（2）空白對照組：未給予任何治療。

（3）生理鹽水組：生理鹽水（1mg／kg體重）皮下注射，1d3次，連續(xù)3d。

（4）陽性對照組：抗生素類藥物西司拉丁鈉（Sigma公司，0．5mg／kg體重）和生理鹽水（0．5 mg／kg體重）皮下注射，1d3次，連續(xù)3d。

1．3．2 丙酮酸治療組

分為不同劑量和不同時間點(diǎn)給藥：（1）選取造模成功的大鼠24只，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組每組8只，觀察不同劑量對敗血癥大鼠的治療效果。不同劑量丙酮酸鹽（乙烷基丙酮酸鹽，Sigma公司）（0．4、4、40mg／kg體重），腹腔注射。

（2）選取造模成功的大鼠24只，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為3組每組8只，觀察不同時間點(diǎn)給藥對敗血癥大鼠的治療效果。選取最佳劑量不同時間點(diǎn)（手術(shù)后12、24、36h）給藥。

（3）選取造模成功的大鼠8只，以最佳給藥時間及給藥濃度給予大鼠丙酮酸鹽治療，對其治療效果予以評價，并與其他各組進(jìn)行比較。

1．4 標(biāo)本采集

各組于造模后開始觀察一般情況，包括體溫、體重等，并于造模后開始每天選取相同時間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈采血1．0mL，肝素鈉抗凝，3000r／min離心15 min，取上清血漿備用。

1．5 指標(biāo)觀察與檢測方法

（1）觀察并記錄各組大鼠8d內(nèi)的行為活動、食欲、呼吸、大小便及死亡率情況。

（2）酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn) （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）測定 TNF－α、IL－6、HMGB－1等炎癥因子水平。

1．6 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行，各組差異的比較使用雙因素方差分析法進(jìn)行分析，各組大鼠存活率的比較使用Kaplan－Meier方法進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±S）表示。

2 結(jié)果

2．1 大鼠一般情況

各組大鼠自手術(shù)后4h開始出現(xiàn)行動遲緩，毛發(fā)蓬松，如刺猬樣，反應(yīng)遲鈍，攝水及攝食明顯減少，8h后部分大鼠精神逐漸萎靡。治療組及陽性對照組，癥狀相似但明顯較輕。各組大鼠體重變化情況見圖1。

圖1 各組大鼠體重變化的比較Fig．1Comparison of weights of rats in different groups

通過對大鼠體重的比較，從第3天起丙酮酸鹽組（丙酮酸鹽組為以最佳給藥時間最佳給藥濃度進(jìn)行治療的一組大鼠）與生理鹽水及空白對照組之間體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與假手術(shù)組及陽性對照組之間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

2．2 最佳給藥濃度及最佳給藥時間的選擇

從手術(shù)后半小時開始分別給予不同濃度丙酮酸鹽（腹腔注射0．4、4、40mg／kg體重，3次／d，連續(xù)3 d）。比較大鼠生存率的差異，結(jié)果顯示（圖2），4 mg／kg體重組與0．4mg／kg體重組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與40mg／kg體重組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。以最佳濃度（4mg／kg體重），分別在不同時間點(diǎn)（建模手術(shù)后12、24、36 h）開始給予大鼠丙酮酸鹽（腹腔注射，3次／d，連續(xù)3d）。比較大鼠生存率的差異，結(jié)果顯示（圖3），術(shù)后24h組與術(shù)后12h組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與術(shù)后36h組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。以建模手術(shù)后24h及4mg／kg體重為本組實(shí)驗(yàn)的最佳給藥時間及最佳給藥濃度。

圖2 不同濃度丙酮酸鹽對大鼠生存率影響的比較Fig．2Comparison of survival rates of rats after giving the different concentrations of pyruvate

2．3 各組大鼠炎癥因子水平比較

圖3 最佳濃度丙酮酸鹽在不同時間點(diǎn)對大鼠生存率影響的比較Fig．3Comparison of survival rates of rats after giving the best concentration of byruvate at different administration points

在實(shí)驗(yàn)過程中，選取8個時間點(diǎn)運(yùn)用ELSA法檢測大鼠血漿中 TNF－α、IL－6、HMGB－1等炎癥因子濃度（圖4）。檢測結(jié)果顯示，各組大鼠血清TNF－α、IL－6濃度在模型建立后即開始增高，空白對照及生理鹽水組較其它3組增高明顯（P＜0．05），在建模后第2天達(dá)最高值后開始下降。各組HMGB－1濃度在模型建立后第2天開始顯著增高，丙酮酸鹽組及假手術(shù)組較其它3組增加緩慢（P＜0．05），到第5天達(dá)最高值后開始下降。對各組大鼠TNF－α濃度進(jìn)行組內(nèi)比較，生理鹽水組及空白對照組第2天濃度與初始濃度相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與第8天相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。對各組間進(jìn)行比較，丙酮酸鹽組與生理鹽水組、陽性對照組及空白對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。對各組大鼠IL－6濃度進(jìn)行組內(nèi)比較，生理鹽水組及空白對照組第2天濃度與初始濃度相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與第8天相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。對各組間進(jìn)行比較，丙酮酸鹽組與生理鹽水組及空白對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與假手術(shù)組及陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。對各組大鼠HMGB－1濃度進(jìn)行組內(nèi)比較，生理鹽水組、陽性對照組及空白對照組第5天濃度與初始濃度相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與第8天相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。對各組間進(jìn)行比較，丙酮酸鹽組與生理鹽水組、空白對照組及陽性對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

圖4 各組大鼠炎癥因子水平的比較Fig．4Comparison of survival rates of rats after gave the best concentration of pyruvate different administration points

2．4 各組大鼠存活率的比較

選取建模成功的大鼠8只，以最佳濃度（4mg／kg體重），在最佳時間點(diǎn)（建模手術(shù)后24h）給予大鼠丙酮酸鹽腹腔注射，3次／d，連續(xù)3d，對其療效進(jìn)行評價，并與其他各組進(jìn)行比較。各組大鼠的存活率分別為（5／8，62．5%；1／8，12．5%；2／8，25%；4／8，50%；6／8，75%），運(yùn)用 Kaplan－Meier方法比較各組大鼠生存率之間的差異，結(jié)果顯示（圖5）丙酮酸鹽組與生理鹽水組及空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），與假手術(shù)組及陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

圖5 最佳濃度丙酮酸鹽，在最佳時間點(diǎn)對大鼠生存率影響的比較Fig．5Comparisocn of survival rates of rats at the best administration time，gave the best concentration of pyruvate

3 討論

本組實(shí)驗(yàn)中，模型建立后不久 TNF－α、IL－6即表現(xiàn)出顯著升高的趨勢，啟動了機(jī)體早期的炎癥反應(yīng)，應(yīng)用抗生素類藥物西斯拉丁納后 TNF－α、IL－6升高趨勢明顯減緩，然而大鼠體重、一般情況及生存分析的結(jié)果表明，與生理鹽水組相比抗生素類藥物并不能有效改善敗血癥大鼠的炎癥狀態(tài)和死亡率（4／8，50%：2／8，25%）。 已 有 的 研 究 表 明，清 除TNF－α、IL－1β可以阻止感染性休克的發(fā)生［1－2］，這些"早期"炎癥介質(zhì)曾被認(rèn)為是引起動物多器官功能損害和死亡的中心因素，然而臨床應(yīng)用TNF－α和IL－1β受體拮抗劑并未取得顯著效果，對于臨床上重癥病人的治療效果欠佳。一些研究結(jié)果證實(shí)，大劑量的內(nèi)毒素導(dǎo)致TNF－α基因敲除小鼠的死亡，并且由內(nèi)毒素血癥和敗血癥引起的死亡發(fā)生在TNF－α高表達(dá)時相的幾天之后，血漿中TNF－α濃度也已恢復(fù)至正常水平［12］。

高遷移率蛋白－1 （high mobility group box－1，HMGB－1）為新近發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)LPS所致遲發(fā)死亡的細(xì)胞因子，是細(xì)胞內(nèi)的一種DNA結(jié)合蛋白，由被激活的巨噬細(xì)胞作為一種前炎癥因子釋放至細(xì)胞外部。體內(nèi)外研究表明，巨噬細(xì)胞在受到內(nèi)毒素刺激20h后釋放 HMGB－1［13－17］。在敗血癥致死的系統(tǒng)性炎癥過程中，HMGB－1可以誘導(dǎo)組織纖溶酶原激活劑釋放，既 而 刺 激 產(chǎn) 生 前 細(xì) 胞 因 子 （TNF－α、IL－1β、IL－8等），還可以提高上皮細(xì)胞的滲透性。以下的研究結(jié)果證實(shí)了HMGB－1在敗血癥的發(fā)生過程中，是一個必需的炎癥介質(zhì)：1）在敗血癥動物模型體內(nèi)以及由細(xì)菌和敗血癥誘發(fā)的多器官功能衰竭的病人體內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)血漿中HMGB－1濃度升高；2）在對小鼠給予注射HMGB－1處理后，出現(xiàn)典型的敗血癥臨床癥狀，如高熱、嚴(yán)重的胃腸道功能紊亂、急性肺損傷，以及致死性的多器官功能衰竭；3）HMGB－1抗體可以抑制內(nèi)毒素的產(chǎn)生，并且糾正已經(jīng)出現(xiàn)的敗血癥癥狀。大量的敗血癥動物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對抗HMGB－1的治療是行之有效的，但是，大部分的抗體阻斷治療，只是中和（清除）了血漿中的HMGB－1，并沒有從源頭上抑制巨噬細(xì)胞對HMGB－1的釋放，導(dǎo)致效率低下［18］。本組實(shí)驗(yàn)中與 TNF－α、IL－6相比 HMGB－1增高明顯滯后，并且在TNF－α、IL－6開始明顯回落后才達(dá)峰值，近一步證明HMGB－1“晚期炎癥介質(zhì)”的身份。因此，尋找抑制巨噬細(xì)胞釋放HMGB－1的治療方案，是解決這一問題的關(guān)鍵。

丙酮酸（CH3COCOOH）是一種3碳α酮類一元羧酸，以糖酵解的終產(chǎn)物形式，作為三羧酸循環(huán)的起始底物，大量存在于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中，一般情況下丙酮酸極不穩(wěn)定，以丙酮酸鹽的形式存在［19］。近來的研究表明，丙酮酸鹽可以抑制巨噬細(xì)胞對HMGB－1的釋放［11－12］。在本組實(shí)驗(yàn)中與抗生素類藥物相比丙酮酸鹽能明顯降低敗血癥大鼠血清HMGB－1水平，不同時間點(diǎn)給藥的結(jié)果表明，在建模手術(shù)后24h開始給藥效果最佳，這與體外巨噬細(xì)胞釋放 HMGB－1的時間接近一致。并且在抑制TNF－α、IL－6等早期炎癥介質(zhì)方面，丙酮酸鹽與抗生素類藥物并無差異。Kaplan－Meier法分析生存率的結(jié)果表明，丙酮酸鹽組與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且二者HMGB－1血清水平也無差異。盡管丙酮酸鹽與抗生素類藥物相比，生存率無統(tǒng)計學(xué)意義，但二者的生存率（6／8，75%；4／8，50%）數(shù)值提示，對于敗血癥大鼠的治療丙酮酸鹽可能具有更好的效果。

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