郝 捷,李 莉,陳 飛,李 楊,孫立梅,王 鶴,侯 靜,張海濤

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學,遼寧沈陽 110866;2.遼寧省微生物科學研究院,遼寧朝陽 122000)

食用菌生產(chǎn)過程中,大多使用木質素、纖維素含量較高的原料,木霉是發(fā)生最為普遍和危害嚴重的真菌病害之一[1-2],其對食用菌的侵染能力非常強[3]。由于大規(guī)模傳統(tǒng)生產(chǎn)多數(shù)使用常溫常壓滅菌,以及運輸過程中菌袋被扎破等原因,使得食用菌發(fā)菌過程中容易受到木霉的侵染。在遼寧省朝陽市召都巴鄉(xiāng)和鞍山市岫巖縣香菇發(fā)菌期間,出現(xiàn)的染菌袋中被木霉侵染的超過半數(shù),發(fā)菌期間不方便開袋使用化學藥劑進行殺滅,地栽期間出現(xiàn)的木霉雖然可以使用多菌靈等化學藥劑,但是木霉對其依然具有較強的抗性,農(nóng)藥殘留對食用菌的品質也會有很大影響[4-5]。芽胞桿菌在動植物生產(chǎn)種植的應用已經(jīng)非常普遍[6-7],而在食用菌栽培生產(chǎn)中應用研究較少,生物防治在食用菌產(chǎn)業(yè)中的應用更顯突出。本試驗將以實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的新菌株對致病菌木霉的生物防治展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在食用菌實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)1株對栽培袋中的致病菌木霉具較強抑菌作用的菌株,經(jīng)挑取純化后命名為B10。木霉(Trichoder m a spp.)T101、T102、T104,本課題組從食用菌染菌的菌袋中分離;木霉29、74(保藏中心編號3.3029,3.2774),遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(Sigma 3K15型);T6-新銳可見分光光度計(北京普析通用有限公司);外徑8 mm牛津杯;細菌微量生化反應管(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 B10菌體與木霉的抑制作用 B10在NA培養(yǎng)基上32℃活化24 h,挑取1環(huán)于10 mL無菌水中,稀釋至10-3,吸取1 mL于PDA平板中,涂布均勻,32℃培養(yǎng)至長出菌落,用8 mm打孔器打孔制成菌碟準備待用。分別挑取木霉29、74、T101、T102、T104各1環(huán)于10 mL無菌水中,稀釋至10-3,吸取1 mL于PDA平板中,涂布均勻,26℃培養(yǎng)48 h,用8 mm打孔器打孔制成菌碟準備待用。將打孔好的B10菌碟,分別與5種木霉接種PDA平板中,菌碟相距3 cm,3次重復,放入恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)72 h后測量抑菌圈大小和拮抗帶寬。拮抗帶寬按照下式計算：

式中,A為抑菌圈的最大直徑(mm),B為抑菌圈的最小直徑(mm),8為牛津杯的外徑(mm)。1.2.2 B10發(fā)酵液對木霉的拮抗作用[8-9]B10發(fā)酵液的制備：將B10接種于LB液體培養(yǎng)基中,32℃,170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液,按5%接種量轉接于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,32℃,170 r/min振蕩培養(yǎng),設置12、24、36、48、60、72 h 6個培養(yǎng)時間段,然后8 000 r/min,4℃離心10 min,取上清液用0.45μm細菌濾器過濾,得到發(fā)酵上清液,存于冰箱,4℃保存?zhèn)溆?。發(fā)酵液拮抗實驗用牛津杯法,將木霉29、74打孔后的菌碟分別接入培養(yǎng)皿距離中心1.5 cm左右位置,培養(yǎng)36 h,待木霉從菌碟上擴散至PDA培養(yǎng)基上,并接近中心位置時,將牛津杯微熱放在培養(yǎng)皿中,距離中心位置1.5 cm左右,與木霉菌碟平行,向牛津杯加入200μL發(fā)酵上清液,培養(yǎng)24 h后,再向牛津杯中加入200μL發(fā)酵上清液,以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照,培養(yǎng)至木霉長滿培養(yǎng)皿,測發(fā)酵上清液抑菌圈大小。

1.2.3 發(fā)酵上清液中蛋白質含量測定 參照文獻[10],以牛血清蛋白為標準蛋白測蛋白質含量。

1.2.4 B10的鑒定 B10生理生化實驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]使用細菌微量生化反應管測定。16S rDNA序列擴增與測序,DNA提取參照《分子生物學實驗指南》[13]中基因組制備的方法,以引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)20 bp和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)19 bp進行PCR擴增,PCR反應條件：預變性98℃5 min;循環(huán)95℃35 s,55℃35 s,72℃1 min 30 s,35個循環(huán),延伸8 min。經(jīng)切膠純化的PCR產(chǎn)物交由生物工程(上海)有限公司完成測序。

2 結果與分析

2.1 B10對木霉抑制作用

如圖1所示,B10對木霉29、74、T101、T102、T104均有不同程度的抑制,拮抗線非常明顯,抑菌圈清晰。因T101與29,T102、T104與74菌落形態(tài)一致,故后續(xù)實驗僅選用木霉29和木霉74。經(jīng)測定,對木霉29、74的抑菌圈分別達到32.3、29.8 mm,拮抗帶寬分別是24.3、21.8 mm,拮抗效果明顯。

2.2 B10發(fā)酵液對木霉的拮抗作用

經(jīng)過6個時間段的培養(yǎng),通過細菌濾器獲得的發(fā)酵上清液對木霉29、74做拮抗實驗,以不接菌的LB培養(yǎng)基為對照組(CK),每個處理設3個重復。實驗結果觀察,抑菌圈呈橢圓形,水平方向為最大直徑,豎直方向為最小直徑,取平均值,結果見表1。在6個時間段中,CK與12 h對木霉均沒有呈現(xiàn)明顯的拮抗圈,拮抗現(xiàn)象不明顯,木霉可以緊貼牛津杯外緣生長。36 h的發(fā)酵上清液對木霉29、74的拮抗效果最佳,拮抗帶寬最長,分別達到16.85、14.23 mm,且最大直徑與最小直徑相差不大,效果最為明顯,見圖2。

圖1 B10對木霉的菌體拮抗Fig.1 Antagonism of bacterium B10 on theTrichoder ma

表1 發(fā)酵上清液對木霉29、74的拮抗抑菌圈大小測定Table 1 Measurement of the size of inhibition zone ofTrichoder ma29 and 74 by the antagonism of abacterial fer mentation liquid

圖2 36 h發(fā)酵上清液對木霉的拮抗Fig.2 Antagonism of abacterial fer mentation liquid onTrichoder mafor 36 h

2.3 發(fā)酵上清液中蛋白質含量

測得牛血清白蛋白的光密度OD595nm見表2,繪制牛血清白蛋白標準曲線見圖3。通過蛋白質標準曲線,得到6個時間段發(fā)酵上清液的蛋白質含量,分別為0.158、0.307、0.441、0.573、0.466、0.549 mg/mL,如圖4所示,48 h發(fā)酵上清液蛋白質含量最高,但36 h對木霉的拮抗效果最佳。

表2 蛋白質標準曲線Table 2 Protein standard curve

圖3 蛋白質標準曲線Fig.3 Protein standard curve

圖4 發(fā)酵上清液蛋白質含量Fig.4 The protein content in abacterial fermentation liquid

2.4 B10鑒定

圖5 B10革蘭染色顯微照片(1 000×)Fig.5 Micrograph of Gram stain of bacterium B10(1 000×)

菌株形態(tài)觀察：菌落圓形,邊緣粗糙,表面隆起、褶皺,乳黃色,菌落不透明,好氧,化能異養(yǎng),1 000倍光學顯微鏡下觀察,菌體呈桿狀,革蘭染色陽性,如圖5。細菌快速生化反應試驗對B10菌的鑒定結果見表3,并參考文獻[14-15],可判斷B10菌為枯草芽胞桿菌(B acillus subtilis)或死谷芽胞桿菌(B acillus vallism ortis)。

表3 B10菌的主要生理學特性Table 3 Physiological characteristics of strain B10

菌株分子鑒定：16S rDNA序列測定片段長度為1 420bp,序列提交GenBank,登錄號：JN112317,比對結果顯示該菌株序列與芽胞桿菌屬同源性最高,相似性大于99%,利用MEGA5的Maximum Likelihood進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,如圖6。與B acillus vallism ortisstrain EA6-11遺傳距離最近,置信度為90,結合生理生化實驗和16S rDNA分子鑒定,確定為死谷芽胞桿菌(Bacillus vallism ortis)。

3 討 論

本試驗所用的菌株,其菌體對食用菌栽培袋中的致病菌木霉拮抗效果比較明顯,進一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液具有較強拮抗作用,發(fā)酵液經(jīng)過離心、過濾等操作步驟,使得有效成分有所損失,需要加大劑量分2次加至400μL才能觀察到明顯的抑菌圈。發(fā)酵上清液具有拮抗作用與存在胞外分泌物有關,通過蛋白質含量測定,72 h與48 h蛋白質含量相當,但拮抗效果不如36 h明顯,說明36 h的有效成分較多。所以在后續(xù)研究中,使用36 h發(fā)酵液即可。

經(jīng)過生理生化實驗和16S rDNA分子鑒定,確定該菌株為死谷芽胞桿菌,它是一類較新的種。芽胞桿菌是較復雜的一個類群,除了較早定的Bacillus subtilis、B.am yloliquefaciens、B.licheniform is、B.pum ilus、B.atrophaeus等5個種外,陸續(xù)分化出B.vallism ortis、B.m ojavensis、B.tequilensis等新種[16]。死谷芽胞桿菌(B.vallism ortis)作為一新種,在應用中還較少利用,本試驗對木霉的拮抗效果非常明顯,將該菌制成菌劑在食用菌栽培過程中的應用,還需深入研究。

圖6 以16S rDNA序列同源性為基礎的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on sequence homology of 16S rDNA

[1] 吳小平,吳曉金,謝寶貴,等.木霉對食用菌侵染機制的初步研究[J].菌物學報,2007,36(增)：441-447.

[2] 孟慶國,王志,鄧春海,等.食用菌病蟲害綜合防治技術要點[J].微生物學雜志,2002,22(2)：60-61.

[3] ParkM S,Bae K S,Yu S H.Molecular andMorphologicalA-nalysis ofTrichoder maisolates associated with GreenMold Epidemic ofOyster mushroom in Korea[J].Journal of Huazhong Agricultural university,2004,23(1)：157-164.

[4] 田連生,陳菲.木霉對多菌靈的生物降解特性研究[J].土壤學報,2009,46(6)：1127-1131.

[5] 曾東方,羅信昌.強力安對食用菌生產(chǎn)中雜菌的毒力測定[J].微生物學雜志,1998,18(3)：37-39.

[6] 蔡雁,郝勃,喻子牛.抗動物病原菌芽胞桿菌的篩選、初步鑒定和抗菌活性[J].微生物學雜志,2005,25(5)：19-22.

[7] 趙陽國,任南琪,程玉鵬.1株芽胞桿菌的分類鑒定及其抑菌產(chǎn)物特性[J].微生物學雜志,2006,26(6)：1-6.

[8] 王剛,張彭湃,陳紅衛(wèi),等.枯草芽胞桿菌B-(1-41)對小麥紋枯病菌的抑制作用[J].微生物學雜志,2006,26(4)：20-22.

[9] 劉瑩,楊翔華,佟明友,等.拮抗菌株的篩選及其發(fā)酵濾液抑菌活性考察[J].微生物學雜志,2006,26(3)：77-80.

[10] MarionM B.AnalyticalBiochemistry,1976,72,248-254.

[11] RE布坎南,NE吉本斯,等.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)[M].北京：科學出版社,1984.

[12] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001.

[13] Sambrook J,RussellDW.Molecule Cloning：A LaboratoryManua1 3rded[M].Beijing,China(北京)：Science Press,2002.

[14] Roberts,M.S.,Nakamura,L.K.,Cohan,F.M.,Bacillus vallismortissp.nov.,a close relative ofBacillus subtilis,isolated from soil in Death Valley[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,1996,46(2)：470-475.

[15] 張慧,楊興明,冉煒,等.土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應[J].土壤學報,2008,45(6)：1096-1101.

[16] 曹鳳明,沈德龍,李俊,等.應用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽胞桿菌[J].微生物學報,2008,48(5)：651-656.