谷 巖 劉廣福 黃 旭 陳曉迪 祝 旭

(遼寧省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，沈陽 110004)

白樹田

(遼寧省北票市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，遼寧北票 122000)

高效液相色譜法測定辣椒中的辣椒堿和二氫辣椒堿

谷 巖 劉廣福 黃 旭 陳曉迪 祝 旭

(遼寧省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，沈陽 110004)

白樹田

(遼寧省北票市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，遼寧北票 122000)

建立了高效液相色譜法(HPLC)測定辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿的檢測方法。實驗考察了儀器條件、不同流動相體系、流動相配比、柱溫、流速等因素對分離的影響。確定了最佳色譜條件為ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；二極管陣列檢測器，辣椒堿、二氫辣椒堿的最佳檢測波長為280 nm；色譜柱溫度為20℃；最佳流動相配比為水-甲醇(體積比為35∶65)，流速為1.0 mL／min；進樣量為5 μL。在最佳色譜條件下，建立了辣椒堿的標準曲線，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。辣椒堿、二氫辣椒堿的加標回收率分別為94.1%～96.8%、92.6%～95.0%，測定結(jié)果的相對標準偏差小于2.0%（n=11）。該法實現(xiàn)了25 min內(nèi)對辣椒堿、二氫辣椒堿的同時測定。

高效液相色譜 辣椒堿 二氫辣椒堿

辣椒堿又名辣素［1］，其化學名稱為8-甲基-N-［(4-羥基-3-甲氧基苯基］-(反)-6-壬烯基酰胺，是從天然植物辣椒中提煉而制得的，其純品為白色晶體［2］，熔點為65℃，幾乎不溶于冷水，易溶于乙醇、丙酮等溶劑中。由于辣椒堿來源于純天然，而且藥理活性特殊，國外開發(fā)應(yīng)用的時間較長，在生物農(nóng)藥中的新用途不斷被開發(fā)，其市場發(fā)展前景相當廣闊。我國辣椒堿的生產(chǎn)應(yīng)用尚處于起步階段，產(chǎn)品以出口為主。由于在國內(nèi)還未實現(xiàn)在醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域中的大量應(yīng)用，因此目前僅限于少量的低濃度產(chǎn)品應(yīng)用于高檔食品添加劑領(lǐng)域，其余大部分產(chǎn)品出口到日本、韓國、美國等國家。各種辣椒深加工產(chǎn)品由于要求不同，往往采用的分析方法也不同，這使得結(jié)果差異很大。辣椒堿含量的常用測定方法有可見分光光度法［3］、亞硝酸鈉比色法［4］、FAO 紫外雙比色法［4］、高效液相色譜法［5］等。

為了促進辣椒深加工制品的生產(chǎn)，依托遼寧省北票地區(qū)辣椒產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢并結(jié)合當?shù)禺a(chǎn)業(yè)鏈，提升加工能力，提高產(chǎn)品附加值，促進當?shù)乩苯樊a(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，筆者研究了高效液相色譜測定辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent HPLC 1200型，配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二級管陣列檢測器，美國Agilent公司；

二氧化碳萃取儀：ASI型，中國環(huán)球分析測試儀器有限公司；

美國密理博純水設(shè)備：Simplicity型，美國密理博公司；

甲醇：色譜純；

辣椒堿、二氫辣椒堿標準樣品：純度不小于98%，北京百靈威科技有限公司；

無水乙醇：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；

辣椒堿、二氫辣椒堿標準儲備液：200 μg／mL，分別稱取10.00 mg的辣椒堿和二氫辣椒堿(按產(chǎn)品標明的純度折算成純標物)，用少量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，混勻。

蒸餾水：實驗室自備。

1.2 樣品制備

稱取不小于100 g的成熟干紅辣椒，在95～100℃條件下干燥至恒重，使水分含量低于0.5%，粉碎，均過420 μm(40目)分析篩，裝入干燥的玻璃磨口瓶中備用。樣品質(zhì)量5 g、夾帶劑為無水乙醇7 mL、萃取溫度40℃、萃取壓力12 MPa、萃取時間 1～1.5 h。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器(DAD)；椒堿、二氫辣椒堿檢測波長：280 nm；流動相：35%水-65%甲醇；流速：1.0 mL／min；柱溫：20℃；進樣量：5 μL。

采用1.2方法進行樣品前處理，按上述色譜條件進行分析得辣椒堿、二氫辣椒堿標準樣品色譜圖見圖1，實際樣品色譜圖見圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

在高效液相色譜分析中，流動相的恰當選擇對改善分離效果能起到重要的輔助作用。從實用角度考慮，選用作為流動相的溶劑應(yīng)當容易購得，使用安全，純度級別高。因此本實驗采用水-甲醇為流動相體系。

實驗考察了80%水-20%甲醇、50%水-50%甲醇、35%水-65%甲醇、20%水-80%甲醇4中不同比例的流動相。當流動相為80%水-20%甲醇時，辣椒堿與二氫辣椒堿幾乎分離不開，隨著流動相中水比例的下降，甲醇含量的增加，辣椒堿與二氫辣椒堿的分離度也逐漸增加，當甲醇含量達到65%時，分離度良好，色譜峰不拖尾，因此實驗選用35%水-65%甲醇為流動相。

2.2 檢測波長的選擇

通過紫外可見分光光度計全波長掃描，發(fā)現(xiàn)辣椒堿和二氫辣椒堿在可見光區(qū)都無較大吸收，當波長為280 nm時，測定組分有較大吸收，因此本實驗選擇280 nm為辣椒堿和二氫辣椒堿的吸收波長。

2.3 柱溫的選擇

柱溫是影響分離度及分析時間的因素之一。一般情況下，溫度升高，可使流動相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓。但溫度太高對分離選擇性有一定的影響，且使流動相易產(chǎn)生氣泡。實驗表明，隨著柱溫的升高，組分保留時間變短。隨溫度變化后兩個組分間的分離度都遠大于1.5，保留時間差足夠大，不影響分離度。但在15℃下二氫辣椒堿保留時間較長，隨著溫度的升高，各組分保留時間無明顯變化，但柱溫過高，對色譜柱的壽命有影響，因此實驗選擇20℃的柱溫。

2.4 流動相流速的選擇

流速對保留時間有一定的影響。流速太低，影響分析的速度；流速過大，系統(tǒng)的壓力太高，容易沖塌柱。實驗發(fā)現(xiàn)，在流速為1.0 mL／min時，進樣開始時的柱壓已達到15.2 MPa，而該色譜柱允許的最大使用壓力為20 MPa；當流速為0.6～1.0 mL／min時，各組分保留時間相當而且都達到了基線分離。綜合考慮分離度、分析效率及色譜柱柱壓情況，實驗選擇最佳流速為1.0 mL／min。

2.5 進樣量的選擇

在液相色譜中，進樣量是影響檢測器靈敏度的關(guān)鍵因素之一。此外，進樣量的大小還會影響色譜峰的峰寬、峰形，嚴重時甚至影響到分離。當進樣量太低時，辣椒堿的靈敏度下降，當進樣量為10 μL時，二氫辣椒堿已經(jīng)發(fā)生拖尾。綜合考慮，實驗選擇5 μL為最佳進樣量。

2.6 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

移取濃度為200 mg／L的辣椒堿、二氫辣椒堿的標準儲備液 0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖 勻，配 制 成 2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100 mg／L的系列標準溶液，按最佳色譜條件進樣分析。分別對辣椒堿、二氫辣椒堿濃度x與對應(yīng)的峰面積y進行線性回歸，得到線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 標準曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

由表1可以看出，辣椒堿、二氫辣椒堿的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，可以滿足日常分析要求。

2.7 準確度與精密度試驗

在確定的最佳色譜條件下，平行測定辣椒樣品11批次，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果

由表2可知，該方法的精密度良好，辣椒堿和二氫辣椒堿的相對標準偏差均小于2.0%，滿足分析要求。

在辣椒樣品中分別添加3個水平濃度標準溶液，按實驗方法進行回收試驗，結(jié)果見表3。由表3可知，辣椒堿和二氫辣椒堿的回收率分別為94.1%～96.8%、92.6%～95.0%，說明方法的準確度較高。

表3 回收試驗結(jié)果(n=11)

3 結(jié)語

采用高效液相色譜法測定辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿。結(jié)果表明，所建立的方法具有快速、經(jīng)濟、靈敏、準確等特點，在北票辣椒基地辣椒制品的檢測中應(yīng)用，結(jié)果令人滿意。

［1］董汝晶，譙順彬.辣椒產(chǎn)業(yè)的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.中國調(diào)味品，2009.10(34)： 32-36.

［2］Feng J N，F(xiàn)u J，Han M L. Research summarizationon capsaicin［J］.Acta Agric Borea Sin，2005，141： 84-87.

［3］楊雅婷，李天俊，叢方地,等.辣椒堿制備及測定方法的研究進展［J］.行業(yè)綜述，2008，20(6)： 14-18.

［4］Nikolaeva D A. Use of aspectrophoto metricmethod for the quantativedeter mination of capsaicininpepper breading by chemicalcomposition［J］. Chemical Abstract，1983,99： 19097C.

DETERMINATION OF CAPSAICIN AND DIHYDROCAPSAICIN IN PEPPER BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Gu Yan， Liu Guangfu， Huang Xu， Chen Xiaodi， Zhu Xu
(Liaoning Province Product Quality Supervision and Inspection Center ， Shenyang 110004， China)

Bai Shutian
(Liaoning Province Beipiao City Quality and Technical Supervision Bureau ， Beipiao 122000， China)

A method to determine capsaicin and dihydrocapsaicin in pepper products simultaneously by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. The effects of mobile phase composition，proportion，column temperature，velocity of flow and injection volume on separation were studied. The best chromatographic conditions were determined： a ZORBAX SB C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm)；a DAD detector； the optimal detection wavelengths of capsaicin and dihydrocapsaicin were 280 nm；the column temperature was 20℃ . The mobile phase was water-methanol(Volume ratio was 35∶65) with flow rate of 1.0 mL／min ；the injection volume was 5 μL. Under the optimal conditions，calibration curves of each substitutes were established，and the related coefficients were 0.999 9. The recoveries of capsaicin and dihydrocapsaicin in samples were 94.1%-96.8%, 92.6%-95.0% respectively. The RSD was less than 2%(n=11). The method has achieved the simultaneous determination on capsaicin and dihydrocapsaicin in 25 minutes.

HPLC，capsaicin，dihydrocapsaicin

2011-08-12