朱文赫,郭志剛,劉紅建,郭祥瑞,孫德軍

(1.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué) 中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

具有自激活切割活性腸激酶輕鏈基因設(shè)計(jì)、表達(dá)及活性研究

朱文赫1,郭志剛2,劉紅建1,郭祥瑞1,孫德軍1

(1.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所 生物技術(shù)藥物教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué) 中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的 獲得 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列 +牛 EKL的 cDNA序列,實(shí)現(xiàn) EKL基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)和自切割。方法 用 Trizol法從牛十二指腸組織中提取總 RNA,利用 RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增其 cDNA片段,將此片段克隆于表達(dá)載體 p GEX-2T,并在其前引入腸激酶 (EK)識(shí)別序列。結(jié)果 所表達(dá)蛋白經(jīng) SDS-PAGE分析,相對(duì)分子質(zhì)量約為 61 000,經(jīng) GST-Sepharose親和色譜柱純化后得到單一蛋白,SDS-PAGE顯示單一條帶,用微量 EK引發(fā)自切割,切斷 GST標(biāo)簽蛋白和 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用對(duì)氨基苯甲脒-Sepharose親和色譜獲得了輕鏈 EK的單體。結(jié)論 成功地克隆、表達(dá)了牛 EK輕鏈基因,采用自激活、切割獲得了 EK單體,每 1 L培養(yǎng)基獲得 EK 5 mg,為進(jìn)一步進(jìn)行重組牛 EK活性的研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

腸激酶;大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng);谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶;自激活

腸激酶 (Enterokinase,EK)是存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶,EK相對(duì)分子質(zhì)量 (Mr)為 150 000,由 1條 Mr115 000重鏈和 1條Mr35 000輕鏈組成。重組融合蛋白經(jīng) EK酶解所釋放的目的蛋白質(zhì) N末端氨基酸序列具有和野生型相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)[1],EK由于專(zhuān)一識(shí)別 5個(gè)氨基酸多肽 (D-D-D-D-K-X1)并在賴(lài)氨酸的羧基上切割,是 N末端融合通常選擇的蛋白酶,在其他殘基的不規(guī)則切割發(fā)生水平較低,這取決于蛋白質(zhì)底物的構(gòu)象。1個(gè)單位定義為在 23℃下切割融合蛋白 50μg在 8 h內(nèi)達(dá)到 95%切割率所需的酶量,這種特點(diǎn)使得 EK成為基因工程融合蛋白表達(dá)后修飾過(guò)程中 1個(gè)極其有用的工具而被廣泛應(yīng)用。天然EK由 1條結(jié)構(gòu)亞基 (重鏈)和 1條催化弧基 (輕鏈)構(gòu)成[2],兩者通過(guò) 1個(gè)分子間二硫鍵結(jié)合,結(jié)構(gòu)亞基負(fù)責(zé)將催化亞基固定在小腸刷狀緣膜上并引導(dǎo)它向腸腔移動(dòng),催化亞基可以特異性識(shí)別 A sp-Asp-A sp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下[3]。EK輕鏈結(jié)構(gòu)在人、牛和豬中相對(duì)保守,其識(shí)別序列 Asp-A sp-Asp-Asp-Lys在脊椎動(dòng)物中也有很強(qiáng)的保守性,且?guī)缀跛斜欢ㄐ虻囊鹊鞍酌冈季哂?4個(gè)天冬酰胺相連的特征,此序列在其他的天然蛋白質(zhì)上又非常罕見(jiàn)[4],而 EK的活性中心有 1個(gè)特殊的陽(yáng)離子位點(diǎn),使得有強(qiáng)大負(fù)電的 Asp-Asp-Asp-Asp可以與此陽(yáng)離子位點(diǎn)結(jié)合。EK輕鏈體外具有全酶酶切特異性,相對(duì)于天然 EK,表現(xiàn)出對(duì)基因工程融合蛋白質(zhì)底物的酶切活性增強(qiáng)[5]。

天然的 EK來(lái)源非常有限,目前獲得 EK的主要方法是從豬、牛等動(dòng)物的十二指腸中分離提取得到,操作步驟繁瑣,提取分離的成本高,而且天然提取的EK易為其它蛋白酶污染,在切割融合蛋白質(zhì)的同時(shí)又降解了目的產(chǎn)物[6],大大影響了其商品價(jià)值。本研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了 p GEX-EKL原核融合表達(dá)載體,為經(jīng)濟(jì)、有效切除 GST部分并獲得與天然結(jié)構(gòu)一致的 EK,在 EK序列的 N端引入 EK位點(diǎn),實(shí)現(xiàn) EK的切割后的自激活和切割,將其在大腸桿菌中表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化、鑒定,為進(jìn)一步進(jìn)行重組牛 EK活性的研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 牛十二指腸購(gòu)于長(zhǎng)春皓月集團(tuán) ;菌株 E.coli DH 5α(DE3)、BL21(DE3)和 p GEX-2T質(zhì)粒由吉林大學(xué)生物藥物研究室保存;pMD18-T載體購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑 所有的限制性?xún)?nèi)切酶、T4酶、Taq DNA聚合酶、Turb RT反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白質(zhì)Marker、IPTG均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司;Trizol購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖均購(gòu)于 Oxiod公司。

1.2 方 法

1.2.1 EKL基因的獲得 牛十二指腸組織置于預(yù)冷的組織研磨器中研磨使其勻漿化,用 Trizol法抽提總 RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RT-PCR得到相應(yīng)的cDNA。根據(jù) GenBank上牛 EK的全基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,為了便于表達(dá)載體的構(gòu)建,引入了 Bam HⅠ和 Eco RⅠ的酶切位點(diǎn):T1(5′-CGGGATCCCCACCATGGAUGAUGAUGAUAAGATTGTCGGAGGAAG)和T2(3′-CCGGAATTCTACATCTTTTGAAACATAGGTGAGAC)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用 Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit(TaKaRa)膠回收試劑盒回收。

1.2.2 EKL原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將 PCR獲得的EKL基因片段連接到 pMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化E.coli BL21,涂布于含有氨芐青霉素 (Amp)的瓊脂板上,挑取陽(yáng)性克隆并進(jìn)行菌落 PCR鑒定和酶切鑒定。將經(jīng)過(guò) E.coli BL21克隆擴(kuò)增的 pMD18-EKL和原核表達(dá)載體 p GEX-2T用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切,產(chǎn)物回收后用 T4-DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切鑒定質(zhì)粒,酶切正確的質(zhì)粒經(jīng)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的誘導(dǎo)表達(dá) 在p GEX-2T表達(dá)系統(tǒng)中融合蛋白質(zhì)的表達(dá)受Lac啟動(dòng)子的調(diào)控,需要 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。挑選轉(zhuǎn)化了 p GEX-rEKL的單克隆接種于含 Amp(100μg/mL)的 2×YT液體培養(yǎng)基 100 mL中,200 r/min 37℃培養(yǎng)至A600為 0.8左右,加入 IPTG至終濃度 0.8 mmol/L,在 25℃培養(yǎng) 3 h。

1.2.4 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌 4℃,6 000 r/min離心 20 min收集菌體,按每 1 mL培養(yǎng)物用去離子水 25μL重懸菌體,加入溶菌酶至終濃度 100μg/mL,室溫放置 15 min。然后按每 1 mL培養(yǎng)物加入預(yù)冷的 pH 7.4,0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS)25μL,按破碎體積選擇合適的超聲波探頭,進(jìn)行超聲破碎。破碎后加入 20%Triton X-100至終濃度為 1%,混勻,放置 30 min,12 000 r/min離心 10 min,獲得超聲破碎的上清和包涵體沉淀。將包涵體依次置于洗滌緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,1%Triton X-100,pH 7.5)、破菌緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,pH 7.5)、變性緩沖液 (0.02 mol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,8 mol/L尿素,0.1 mol/Lβ-巰基乙醇,pH 7.5)中進(jìn)行溶解,4℃透析至尿素終濃度為 0.1 mol/L,離心后上清液與超聲破碎后的上清合并后與谷胱甘肽 Sepharose 4B柱結(jié)合,依次用PBS和谷胱甘肽洗脫液洗 3次,收集洗液進(jìn)行 SDSPAGE分析。

1.2.5 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的酶切 將含有融合蛋白質(zhì)的谷胱甘肽洗脫液透析除鹽后,進(jìn)行 EK切割,按每 100 mg融合蛋白質(zhì)加 EK 0.1μg,23℃酶切過(guò)夜,然后取樣進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè),反應(yīng)后的體系通過(guò)對(duì)氨基苯甲脒-Sepharose 4B凝膠柱,含 0.5 mol/L NaCl的 Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)洗脫 ,收集洗脫峰,即為重組 EK。

1.2.6 重組 EK的活性檢測(cè) 將純化后的重組 EK對(duì)重組融合蛋白質(zhì) GST-金黃色葡萄球菌蛋白 A進(jìn)行酶切,重組 EK與融合蛋白質(zhì)的比例分 1∶100,23℃酶切過(guò)夜,然后取樣進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 EKL DNA片段的 PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用 RT-PCR擴(kuò)增獲得大小約 700 bp的目的片段 (圖 1),將片段純化酶切后克隆于經(jīng)同樣酶切的p GEX-2T載體上,用 Bam HⅠ、Eco RⅠ雙酶切鑒定,片段大小正確 (圖 2)。

圖1 EKL DNA片段的 RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 The amplified EKL fragment by RT-PCR

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by digestion with Bam HⅠ and Eco RⅠ

2.2 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)質(zhì)粒 p GEX-rEKL轉(zhuǎn)化 E.coli BL21,37℃搖菌培養(yǎng)至菌 A600為 0.8左右,用終濃度為 0.8 mmol/L的 IPTG,25℃誘導(dǎo)表達(dá) 3 h。SDS-PAGE結(jié)果表明在Mr約 61 000處有特異表達(dá)條帶,大小與推測(cè)的目的融合蛋白質(zhì) Mr大小相符合 (圖 3)。發(fā)酵后的菌體經(jīng)過(guò)超聲破碎后分別取菌液上清、菌體、破碎上清和破碎沉淀做 SDS-PAGE,結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)為胞內(nèi)表達(dá),部分形成包涵體,部分以可溶形式存在 (圖 4)。

圖3 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig.3 SDS-PAGE analysisof induced GST-EKL expression

圖4 超聲破碎后融合蛋白質(zhì) GST-EKL的定位分析Fig.4 GST-EKL location analysis after hypersound breaking

2.3 融合蛋白 GST-EKL的純化

將包涵體用尿素溶解后進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示包涵體中的蛋白質(zhì)成功地被溶解純化 (圖5)。將含有融合蛋白質(zhì)的清液通過(guò) GST-Sepharose親和色譜純化后進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示融合蛋白質(zhì)被成功純化,洗脫峰呈現(xiàn)單一條帶,Mr約為61 000(圖6)。

2.4 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的自切割及純化

GST-Sepharose親和色譜柱純化后的 GST-EKL融合蛋白質(zhì)用少量 EK切割引導(dǎo),除去 GST標(biāo)簽,SDS-PAGE結(jié)果顯示融合蛋白質(zhì)成功被 EK切開(kāi),分為 GST標(biāo)簽和輕鏈 EK兩部分 (圖 7),而切割出的EK繼續(xù)能切割體系中未完全切開(kāi)的 GST-EKL融合蛋白,實(shí)現(xiàn)整個(gè)體系的自激活及切割,酶反應(yīng)的混合物通過(guò)對(duì)氨基苯甲脒親和色譜柱再次純化,去除雜蛋白質(zhì),得到純品。

圖5 包涵體尿素溶解的 SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysisof IBsof GST-EKL

圖6 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的親和色譜純化Fig.6 Purification of the fusion protein GST-EKL

圖7 融合蛋白質(zhì) GST-EKL的腸激酶引發(fā)自切割及對(duì)氨基苯甲脒親和色譜Fig.7 SDS-PAGE analysis of GST-EKL by digestion with EK and purified p roteinsof EKL

2.5 重組 EK的活性鑒定

純化后 E.coli表達(dá)的 EK濃度為 5.8 mg/mL,SDS-PAGE顯示純化后的 EK酶切效果好,在與融合蛋白質(zhì)混合后,當(dāng)酶與 GST-金黃色葡萄球菌蛋白 A比值為 1∶100時(shí),目的融合蛋白質(zhì)的被切割率在95%以上,結(jié)果見(jiàn)圖 8。圖 8出現(xiàn)了Mr26 000(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)酶)和 32 000兩條帶,結(jié)果表明,我們制備出了具有生物活性的 EK。

圖8 表達(dá)的腸激酶對(duì)融合蛋白質(zhì)酶切的 SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE clevaging analysisof EK on fusion p rotein

3 討 論

EK是胰蛋白酶原的生理激活劑,EK在體內(nèi)激活胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶,而胰蛋白酶是消化系統(tǒng)其它許多酶原的激活劑,因此 EK被認(rèn)為是消化系統(tǒng)重要的起始酶之一[7]。一般認(rèn)為 EK存在于小腸刷狀緣細(xì)胞膜上,病理研究發(fā)現(xiàn),十二指腸與胰腺的回流液中富集 EK會(huì)激活過(guò)多的胰蛋白酶原從而導(dǎo)致急性胰腺炎,而 EK缺陷的機(jī)體將會(huì)有腹瀉、嘔吐、浮腫等癥狀,造成發(fā)育不良,導(dǎo)致血蛋白不足癥和貧血[8]。由于天然的 EK來(lái)源非常有限,本研究采用基因工程手段在原核表達(dá)載體中成功地表達(dá)和純化了 EK輕鏈蛋白,可以解決前人純化高成本、步驟繁瑣的不足。

載體方面,表達(dá)載體用 p GEX-2T載體,其上具有 Plac啟動(dòng)子,能被乳糖類(lèi)似物如 IPTG誘導(dǎo),從而實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控和降低雜蛋白質(zhì)本底,載體上帶有 Amp的抗性基因,便于對(duì)重組陽(yáng)性克隆菌的篩選,而且載體還自帶 GST-tag,由于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶能夠增加外源蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá),所以我們將目的蛋白質(zhì)構(gòu)建在 GST標(biāo)簽蛋白下游來(lái)增加 EK的可溶性,同時(shí)帶有 GST標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)能通過(guò) GST-Sepharose親和色譜柱洗脫得到,我們已成功地應(yīng)用該表達(dá)載體表達(dá)了多種生物活性蛋白[9-10]。

本研究成功的將 EK序列的 N末端引入 EK切割位點(diǎn),表達(dá)了 EK輕鏈,在表達(dá)了 GST融合蛋白的同時(shí),實(shí)現(xiàn)用少量 EK引發(fā)切割融合蛋白反應(yīng),致使EK產(chǎn)生與切割瀑布式放大,最終使整個(gè)體系完成自切割,可以得到具有天然 N末端氨基酸序列的 EK,由于 EK屬絲氨酸蛋白酶,所以選擇對(duì)氨基苯甲脒親和色譜柱,除去雜質(zhì)蛋白,得到高純度的 EK蛋白,每 1 L培養(yǎng)基獲得 EK約為 5.0 mg,簡(jiǎn)化了下游純化工藝的難度,便于擴(kuò)大化生產(chǎn),促進(jìn)了 EK在生物工程等領(lǐng)域的應(yīng)用。

[1] 張向輝,譚樹(shù)華,李泰明.腸激酶特點(diǎn)及其基因工程的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2005,12(5):347-350.

[2] Mikhailova A G,Rumsh L D.Structural characteristics providing for high specificity of enteropeptidase[J].Bioorg Khim,1998,24(4):282-287.

[3] Light A,Janska H.The amino-terminal sequence of the catalytic subunit of bovine enterokinase[J].Protein Chem,1991,10(5):475-450.

[4] Yuan L D,Hua Z C.Expression,purification and characterization of a biologically active bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2002,25(2):300-304.

[5] Choi S I,Song H W,Moon JW,et al.Recombinant enterokinase light chain with affinity tag:expression from Saccharomyces cerevisiae and its utilities in fusion protein technology[J].Biotechnol Bioeng,2001,75(6):718-724.

[6] Tan Haidong,Wang Jinxia,Zhao Zongbao.Purification and refolding optimization of recombinant bovine enterokinase light chain overexpressed in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2007,56(1):40-47.

[7] Lei F,Sun QM,Hua ZC.Expression of recombinant Chinese bovine enterokinase catalytic subunit in pastoris and its purification and characterization[J].Acta Biochimica Biophysica Sinica,2004,36(7):513-517.

[8] Light A,Janska H.Enterokinase(enteropeptidase):comparative aspects[J].Trends Biochem Sci,1989,14(3):110-112.

[9] 朱文赫,王 涵,孫妙囡,等.蜂毒明肽基因的原核表達(dá)及其純化[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2009,22(10):971-974.

[10]朱文赫,田立玲,孫妙囡,等.蜂毒肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及初步鑒定[J].中國(guó)生化藥物雜志,2010,31(1):1-5.

Clone and expression of bovine recombinant enterokinase catalytic subun it in Escherichia coli,self-activation cutting and assement assessm en t of b ioactivity

ZHU Wen-he1,GUO Zhi-gang2,LIU Hong-jian1,GUO Xiang-rui1,SUN De-jun1
(1.Department of Biomedicine,Institute of Frontier Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Orthopaedics,China-Japan Union Hospital of Jinlin,Jilin University,Changchun 130033,China)

Purpose The sequence of bovine EKL gene with Asp-A sp-Asp-A sp-Lys sequence in the N-terminus was obtained and analyzed,and the fusion protein of the EKL-GST was produced in E.coli.Methods The fragment of bovine enterokinase light chain cDNA was obtained by RT-PCR from bovine′s duodenal mucosa,then cloned into the pMD18-T cloning vector and sequenced.Compared with the sequence deposited in GenBank,the cloned gene sequence is correct.Then the interested gene fragment was inserted into the pGEX-2T expression plasmid.The recombinant vector pGEX-rEKL was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG.Results SDS-PAGE analysis indicated that the target product was about 61 kDa.The research successfully clones and expresses EKL-GST fusion protein in E.coli.Selt-activation by microamount cutting the fusion protein,and purified the EKL by minobenzene-Sepharose.Conclusion This investigation would be able to lay a foundation for enterokinase activity research and further application of expression products on a large scale.

enterokinase;Escherichia coli;expression system;GST self-activation

Q78

A

1005-1678(2011)01-0006-05

2010-01-28

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20060564)

朱文赫,男,博士研究生;孫德軍,通信作者,Tel:0431-85619233,E-mail:sundjjl@yahoo.com.cn。