蔡文娣,初洪菊,初金鑫,付辰煒,韓寶芹,劉萬(wàn)順

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部,山東 濰坊 261053;2.山東省平度市中醫(yī)醫(yī)院,山東 平度 266700;3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

羧甲基殼聚糖鈣(carboxymethyl chitosan calcium,CCC)是以羧甲基殼聚糖為原料制備而成[1],具有預(yù)防性和治療性排鉛的功效[2-3],在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其在排鉛的同時(shí)可能具有一定的抗氧化功效和肝保護(hù)作用。本研究建立了CCl4誘導(dǎo)的昆明小鼠的肝損傷膜型,通過(guò)測(cè)定血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性,肝臟中脂質(zhì)過(guò)氧化程度,肝臟總抗氧能力(T-AOC),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px),超氧化物歧化酶(SOD)等指標(biāo)研究了CCC的抗氧化及肝保護(hù)功能。

1 材 料

CCC,中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院制備;CCl4,天津市大茂化學(xué)試劑廠;丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、GSH-Px測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、T-AOC測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

雄性昆明小鼠(22～25 g),購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(魯)20050015。

TU-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Synchron CX-7生化測(cè)定儀,美國(guó) Beckman有限公司。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為5組,每組8只,分別為:正常對(duì)照組、CCl4模型組、CCC低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組,灌胃給予受試物。

對(duì)照組:每天給予相應(yīng)體積的蒸餾水,20 d;CCl4損傷組:每天給予相應(yīng)體積的蒸餾水,于第20天腹腔注射 CCl4(20mg/kg,用花生油稀釋);CCC低、中、高劑量組:每天灌胃 CCC,劑量分別為0.125,0.25,0.5 g/(kg·d),于第20天末次給藥 3 h后腹腔注射 CCl4(20mg/kg,用花生油稀釋)。

小鼠經(jīng)CCl4損傷 24 h后,摘眼球取血,分離得到血清,測(cè)定血清中 ALT、AST活性。同時(shí)斷頸處死小鼠,取肝臟,稱重,制得勻漿液。

2.2 血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定

AST、ALT活性在Synchron CX-7生化測(cè)定儀上進(jìn)行測(cè)定。

2.3 T-AOC、MDA、GSH-Px、SOD的測(cè)定

肝勻漿中各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)的測(cè)定按照試劑盒中的操作方法進(jìn)行。

2.4 肝勻漿中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

肝勻漿中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法 )。

2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析 (ANOVA),用最小顯著差法(LSD法)檢驗(yàn)作兩兩比較。

3 結(jié) 果

3.1 血清中 AST、ALT活性

結(jié)果見(jiàn)表1。腹腔注射 CCl4能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟毒性,CCl4作用24 h后,血清中 AST、ALT含量與對(duì)照組相比分別升高了5.24和10.6倍,差異顯著 (P＜0.05),造模成功。試驗(yàn)結(jié)果表明 CCC低、中、高劑量組都有效地降低了AST、ALT的活性(P＜0.05)。

表1 CCC對(duì)CCl4肝損傷小鼠ALT、AST活性和MDA含量的影響(n=8,±s)Tab.1 Influence of CCC on ALT,AST and MDA in CCl4-injured mice(n=8,±s)

表1 CCC對(duì)CCl4肝損傷小鼠ALT、AST活性和MDA含量的影響(n=8,±s)Tab.1 Influence of CCC on ALT,AST and MDA in CCl4-injured mice(n=8,±s)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與肝損傷模型組比較:2 P＜0.051 P＜0.05 vs normal group;2P＜0.05 vsmodel group

組別 劑量/(mg/kg) AST/(u/L) ALT/(u/L) MDA/(nmol/mg prot)正常對(duì)照組 - 161.02±20.57 57.81±4.96 0.93±0.23肝損傷模型組 - 843.31±118.601 614.11±30.9113.10±1.231 CC低劑量組 125 638.97±188.581,2 541.77±30.751,2 2.41±0.391,2 CCC中劑量組 250 645.25±125.661,2 420.77±48.981,2 2.07±0.501,2 CCC高劑量組 500 648.51±134.581,2 414.50±39.491,2 2.02±0.411,2

3.2 肝勻漿生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3.2.1 MDA測(cè)定結(jié)果 如表1所示,CCl4肝損傷模型組的脂類過(guò)氧化產(chǎn)物——MDA的含量升高,差異顯著(P＜0.05,與正常對(duì)照組相比),造模成功。CCC灌胃給藥 20 d明顯抑制了CCl4誘導(dǎo)的脂類過(guò)氧化,低、中、高劑量組都顯著降低了肝臟中的MDA水平(P＜0.05,與模型組相比)。

3.2.2 SOD測(cè)定結(jié)果 如表2所示,肝損傷模型組的SOD活性降低,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05),CCC灌胃給藥 20 d顯著提升了肝臟中 SOD活性(P＜0.05,與模型組相比)。

3.2.3 GSH-Px測(cè)定結(jié)果 如表2所示,肝損傷模型組的GSH-Px活性顯著降低,與對(duì)照組相比差異顯著 (P＜0.05)。CCC灌胃給藥 20 d低、中、高劑量組都能提升 GSH-Px活性,但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.4 T-AOC測(cè)定結(jié)果 如表2所示,肝損傷模型組總抗氧化能力下降,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05),CCC灌胃給藥 20 d能顯著提升 T-AOC水平(P＜0.05,與模型組相比)。

4 討 論

CCl4肝損傷模型是經(jīng)典化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型,CCl4進(jìn)入體內(nèi)后被肝臟微粒體細(xì)胞色素氧化酶P-450激活產(chǎn)生活潑的三氯甲基自由基,誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化從而損害肝細(xì)胞的細(xì)胞膜,使內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶釋放到細(xì)胞外,導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高[4]。

表2 CCC對(duì)CCl4肝損傷小鼠 SOD、GSH-Px和T-AOC的影響(n=8,±s)Tab.2 Influence of CCCon SOD,GSH-Px and T-AOCin CCl4-injured mice(n=8,±s)

表2 CCC對(duì)CCl4肝損傷小鼠 SOD、GSH-Px和T-AOC的影響(n=8,±s)Tab.2 Influence of CCCon SOD,GSH-Px and T-AOCin CCl4-injured mice(n=8,±s)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與肝損傷模型組比較:2 P＜0.051 P＜0.05 vs normal group;2P＜0.05 vs model group

組別 劑量/(mg/kg)SOD/(u/mg prot) GSH-Px/(u/mg prot)T-AOC/(u/mg prot)正常對(duì)照組 - 81.23±7.52 160.86±4.04 2.39±0.18肝損傷模型組 - 43.85±8.311 131.63±9.751 1.10±0.161 CCC低劑量組 125 58.58±5.101,2 137.50±8.181 1.57±0.341,2 CCC中劑量組 250 67.27±5.401,2 139.50±10.061 1.82±0.421,2 CCC高劑量組 500 68.63±4.691,2 139.52±10.001 1.86±0.311,2

AST和ALT活性的高低能夠反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,本試驗(yàn)結(jié)果表明 CCC灌胃給藥能夠抑制CCl4誘導(dǎo)的血清中 AST和ALT活性的升高,提示CCC具有肝保護(hù)功能。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物,測(cè)定其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過(guò)氧化程度[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 CCl4明顯誘導(dǎo)肝臟中脂質(zhì)過(guò)氧化,MDA含量升高,而CCC灌胃給藥能夠降低 MDA的含量,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,提示 CCC具有肝保護(hù)功能。

機(jī)體抗氧化防御能力的強(qiáng)弱與健康程度存在密切聯(lián)系,測(cè)定機(jī)體的總抗氧化能力具有重要意義。鄭小麗等[6]的研究表明,總的抗氧化能力下降應(yīng)該主要是抗超氧陰離子自由基的能力下降,對(duì)應(yīng)的應(yīng)是SOD酶的活力下降。很多研究表明 CCl4對(duì)肝的損傷可表現(xiàn)為參與氧化解毒的酶(SOD、GSH-Px)活性的下降。本試驗(yàn)結(jié)果與之相符,模型組總的抗氧化能力下降,SOD和GSH-Px酶的活力下降。提前灌胃給藥能顯著提高機(jī)體總抗氧化能力和SOD活性,提示 CCC是有效的抗氧化劑,能提高機(jī)體的防御機(jī)能。而GPH-Px的活力在模型組和實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P＞0.05),可能因?yàn)镚SH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,受試物對(duì)其不能起修復(fù)激活作用,具體機(jī)制有待深入研究。

總之,本研究結(jié)果表明,CCC對(duì)于CCl4造成的肝損傷具有一定預(yù)防功效,能夠提高機(jī)體的抗氧化能力,為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

[1]蔡文娣,初金鑫,韓寶芹,等.羧甲基殼聚糖鈣的制備及性質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,30(2):167-168.

[2]蔡文娣,韓寶芹,王常紅,等.羧甲基殼聚糖鈣對(duì)染鉛小鼠排鉛作用的初步研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2006,40(6):415-418.

[3]初金鑫,韓寶芹,蔡文娣,等.羧甲基殼聚糖鈣對(duì)染鉛小鼠治療性排鉛作用的研究[J].中國(guó)海洋藥物,2007,26(1):28-30.

[4]Palmes D,Spiegel H U.Animal models of liver regeneration[J].Biomaterials,2004,25(9):1601-1611.

[5]肖增平,吉愛(ài)國(guó),宋淑亮,等.絞股藍(lán)多糖對(duì)小鼠四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)生化藥物雜志,2008,29(3):186-188.

[6]鄭小麗,王風(fēng)玲,范 洪,等.檢測(cè)Ⅱ型糖尿病患者總抗氧化能力的臨床意義[J].現(xiàn)代診斷與治療,1999,10(3):144-145.