高 虹，陳 明，鄭津輝

（天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

醫(yī)用脲酶菌的固定化比較研究

高 虹，陳 明，鄭津輝

（天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

以聚乙烯醇為載體，分別通過化學(xué)法與物理法對醫(yī)用脲酶菌進(jìn)行包埋，并比較了2種方法所制備微球的性能及血清尿素清除活性.化學(xué)法采用硼酸交聯(lián)，當(dāng)調(diào)節(jié)硼酸p H至6.5時所得固定化微球比未調(diào)硼酸p H（4.0）的微球有較高的機(jī)械強(qiáng)度及尿素吸收活性；物理法采用冷凍交聯(lián)，所得微球粒徑均一，機(jī)械強(qiáng)度較好，冷凍交聯(lián)微球吸收尿素的活性與未調(diào)p H（4.0）的硼酸交聯(lián)微球接近，而略低于p H 6.5硼酸交聯(lián)微球.體外尿毒癥模擬血清尿素清除試驗表明，化學(xué)法硼酸（p H 6.5）交聯(lián)的固定化脲酶菌尿素吸收活性最高，8 h尿素清除率達(dá)97%，若經(jīng)培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)24 h，則尿素吸收活性明顯增加，6 h清除率為97.2%.

脲酶菌；尿毒癥；口服微球；固定化；聚乙烯醇

尿素是最早被認(rèn)定的一種尿毒癥毒素，它在體內(nèi)的蓄積會引起一系列中毒癥狀，臨床上一直把尿素作為尿毒癥毒素的清除指標(biāo).口服吸附劑治療尿毒癥是基于腸胃清除尿毒癥毒素的一條新路，尚處于研究階段.由肝臟產(chǎn)生的尿素有20%將隨血流擴(kuò)散到人體腸道中去，口服尿素的特異性吸附劑后，腸道中尿素將不斷被吸附劑吸收，從而間接達(dá)到降低尿毒癥患者血液中毒素水平的目的.與血液透析和血液灌流相比，口服藥物的治療方法具有價格低廉和使用方便的優(yōu)點.口服吸附劑如活性碳、氧化淀粉、氧化纖維素等化學(xué)物質(zhì)能吸附腸內(nèi)氮代謝產(chǎn)物并能有效地治療尿毒癥［1－4］.但由于受吸附容量的限制，需加大使用劑量，且部分吸附劑本身就有毒性或是含鋁制劑，因此仍需開發(fā)能吸附尿毒癥毒素而本身無毒性的吸附劑，越來越多的研究轉(zhuǎn)向生物酶系統(tǒng)［5－10］.由于固定化細(xì)胞是天然的多酶系統(tǒng)，保持了酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，無須輔因子再生，增加了酶的穩(wěn)定性，因此，活的微生物細(xì)胞成為尿毒癥毒素較理想的生物吸附劑.加拿大麥吉爾大學(xué)人工細(xì)胞及人工器官研究中心Chan和Prakash等研究制備了固定化的尿素酶基因工程菌株，通過活菌體自身存在的酶系統(tǒng)在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化尿毒癥毒素為細(xì)菌自身營養(yǎng)物［11－16］.由于其固定化采用APA（海藻酸鈉－聚賴氨酸－海藻酸鈉）為包埋材料，而APA微囊機(jī)械強(qiáng)度有限，阻止了它的進(jìn)一步臨床應(yīng)用.

聚乙烯醇具有強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物分解性能強(qiáng)、對微生物無毒、價格低廉等一系列優(yōu)點，是一種新型的微生物包埋固定化載體.且聚乙烯醇在人體腸道內(nèi)對人體的毒性極低［17－18］，不被腸道吸收，也不會誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生突變，作為藥物包埋載體對人體是非常安全的.

本研究以聚乙烯醇為載體通過物理法及化學(xué)法對前期工作所獲得的脲酶菌［19］進(jìn)行包埋，并測定了固定化脲酶菌體外清除尿素的活性.

1 材料與方法

1.1 菌種

Enterobactergergovia是從尿毒癥病人腸道中分離得到的一株脲酶菌，并經(jīng)紫外線及硫酸二乙酯誘變處理［19］.

1.2 培養(yǎng)基

葡萄糖3 g／L，蛋白胨0.1 g／L，酵母膏0.1 g／L，KH2PO41 g／L，K2HPO40.5 g／L，NaC1 0.5 g／L，尿素6%（體積質(zhì)量濃度）.

1.3 培養(yǎng)方法

從平板上挑取脲酶菌接種于裝有10 m L液體培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中，37℃培養(yǎng)48 h，再轉(zhuǎn)入裝有50 m L液體培養(yǎng)基的250 m L三角瓶中，擴(kuò)大增殖24 h，離心洗滌收集菌體，稱濕重，再用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞到所需體積用于微球包埋.

1.4 脲酶菌的包埋

1.4.1 化學(xué)法包埋［20］

具體步驟如下：根據(jù)所需濃度稱取一定量聚乙烯醇（PVA，平均聚合度2 450±50，醇解度98%～99%）和10 mg海藻酸鈉（相對分子質(zhì)量為198.11）于圓底燒瓶中，加入9 m L蒸餾水，90℃水浴加熱溶解后，鋁箔紙封口，濕熱滅菌.另將1 m L菌懸液（含脲酶菌0.8 g）與上述聚乙烯醇溶液混勻，即包埋菌體量為80 mg／m L PVA溶液.在超凈臺上用注射器將該混合液滴入體積質(zhì)量2%CaCl2的飽和硼酸無菌溶液（p H 4.6，或 Na2CO3調(diào)p H 至6.8）中，室溫磁力攪拌狀態(tài)下保持24 h，再用無菌生理鹽水洗滌微球，4℃濕態(tài)保存.

1.4.2 物理法包埋［21］

具體步驟如下：取已滅菌的機(jī)油100 mL與1.5 mL司班80，于250 m L無菌三口瓶中電動攪拌混勻.配制體積質(zhì)量為0.1%海藻酸鈉的聚乙烯醇水溶液，90℃水浴加熱溶解并滅菌.取2 m L菌懸液（含脲酶菌1.6 g）與18 m L聚乙烯醇水溶液混勻，加入到上述三口瓶中，室溫電動攪拌30 min分散.將盛有冰鹽浴（碎冰∶鹽＝3∶1）的容器置于三口瓶外部，在攪拌的同時快速冷凍三口瓶內(nèi)所形成的液珠.30 min后，將三口瓶置于－20℃冰箱冷凍24 h.解凍時，將三口瓶放于冰鹽浴中，將冰鹽浴置于4℃冰箱放置24 h，然后于室溫繼續(xù)解凍.取出用已滅菌洗潔凈／生理鹽水篩洗微球.4℃濕態(tài)保存.

1.5 微球粒徑分布測量

分別用18目、20目、40目、60目不銹鋼篩對不同大小的微球進(jìn)行分離.

1.6 微球機(jī)械強(qiáng)度的測定

將100個微球放入含10 m L蒸餾水的50 m L三角瓶中，并加入10個玻璃珠，以提高碰撞幾率和強(qiáng)度.以150 r／min轉(zhuǎn)速在37℃搖床中振蕩，分別于一定時間間隔取出微球，在顯微鏡下觀察微球的破碎情況.

1.7 微球通透性的測定

取5 mL微球，加入到50 mL尿素水溶液（1 mg／mL）的250 mL三角瓶中，于37℃，100 r／min搖床中擴(kuò)散平衡，每0.5 min取樣0.5 m L，采用二乙酰一肟法測定尿素濃度［22］，通過溶液中尿素濃度達(dá)到平衡的時間來表示微球的通透性.

1.8 微球體外模擬試驗

將上述制備的微球平均分成2份，取其中一份加入到50 m L模擬血清中（向50 m L牛血清中添加尿素50 mg），每隔2 h取樣進(jìn)行尿素轉(zhuǎn)化率測定.

2 結(jié)果與分析

本實驗以聚乙烯醇為包埋材料，采用硼酸交聯(lián)及冷凍交聯(lián)2種方法對脲酶菌進(jìn)行固定包埋，并比較了這2種方法所制備微球的性能.

2.1 微球粒徑分布

2.1.1 硼酸交聯(lián)微球粒徑分布

硼酸交聯(lián)的微球制備采用液滴法，壓縮氮氣被輸入圍于針頭外層的同心圓氣路，并從接近針頭處輸出，在針頭處形成較大的剪切力，將來自針頭的混合液射流切割成細(xì)小液滴［20］.隨著包埋劑聚乙烯醇濃度增加，其操作難度也隨之增加.當(dāng)聚乙烯醇體積質(zhì)量為5%及6%時形成20～40目微球較容易，當(dāng)聚乙烯醇體積質(zhì)量為7%時形成的微球粒徑主要分布在18～20目，當(dāng)聚乙烯醇體積質(zhì)量為8%時由于粘度太大，較難形成大小一致且有規(guī)則的微球.經(jīng)一系列不銹鋼篩對所制備的微球進(jìn)行篩選計數(shù)后，得到微球粒徑的分布圖如圖1（a）所示.

圖1 微球粒徑分布Figure 1 Distribution of microsphere diameter

2.1.2 冷凍交聯(lián)微球粒徑分布

冷凍交聯(lián)的微球制備采用鍋包法.鍋包法制備的微球粒徑大小分布比較均勻，基本集中在20～40目之間，將這些微球計數(shù)統(tǒng)計后，得到冷凍交聯(lián)微球粒徑的分布圖如圖1（b）所示.由圖1（b）可以看出，冷凍交聯(lián)微球粒徑大小與聚乙烯醇濃度關(guān)系不大.

利用冷凍法制備的微球粒徑均一，且聚乙烯醇濃度可以設(shè)定得較高，便于提高微球的機(jī)械強(qiáng)度.而液滴法制備硼酸交聯(lián)的微球粒徑分布稍寬，聚乙烯醇最大體積質(zhì)量只能達(dá)7%，再高就難以滴制成型.因此，從微球的粒徑整齊度考慮，冷凍法更易于操作.

2.2 微球機(jī)械強(qiáng)度

2.2.1 硼酸交聯(lián)微球的機(jī)械強(qiáng)度

如圖2（a）所示，經(jīng)Na2CO3調(diào)節(jié)飽和硼酸溶液p H值到6.5后，形成的微球機(jī)械強(qiáng)度大大提高，經(jīng)8 h機(jī)械震蕩微球破碎率為2%～3%，8 h～24 h不再有新增破碎；而未調(diào)p H值所形成的微球，1～24 h內(nèi)微球破碎率一直處于上升趨勢，24 h時的破碎率最高為18%.未調(diào)p H所形成的微球經(jīng)檸檬酸鈉處理后，微球內(nèi)不溶性的海藻酸鈣轉(zhuǎn)變成可溶性的海藻酸鈉，微球顏色由白色轉(zhuǎn)變?yōu)橥该魃?；?jīng)調(diào)整p H后所形成的微球，經(jīng)檸檬酸鈉處理以后，微球由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该魃?，表明其?nèi)部交聯(lián)程度較高.飽和硼酸的p H值為4.0，對脲酶菌也有毒性作用，而且p H值也影響聚乙烯醇的凝膠化作用［23］.據(jù)報道，硼酸在p H值大于7時是聚乙烯醇良好的交聯(lián)劑，在p H值小于5時基本不起交聯(lián)作用.因此，使用硼酸交聯(lián)法制備微球時，最佳方法是預(yù)調(diào)飽和硼酸p H值到6.5～7.0之間，即可減少固定化細(xì)胞活性損失，還能增加微球內(nèi)部交聯(lián)度.

圖2 微球強(qiáng)度測試24 h后的破碎率Figure 2 Breakege ratio of microspheres after 24 h test for mechanical strength

2.2.2 冷凍交聯(lián)微球的機(jī)械強(qiáng)度

黃光琳等［24］通過透射電子顯微鏡觀察體積重量為12%PVA（MW∶1 700）水溶液凝膠化的形成過程：在253 K冷凍12 h時，只出現(xiàn)了固液相分離狀況，這時尚無較明顯的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)形成；繼續(xù)冷凍24 h，觀察到由相分離所致的網(wǎng)孔由稀疏到緊密，逐漸形成和趨于完善.本實驗選擇一次冷凍24 h制備PVA微球，在實驗濃度范圍內(nèi)，微球機(jī)械強(qiáng)度隨聚乙烯醇濃度的增大而增大（圖2（b））.

影響這種凝膠脆性的最重要因素是解凍條件，一般說來，解凍愈慢，凝膠強(qiáng)度越高.緩慢解凍能夠確保樣品有足夠的時間停留在－5～1℃這一溫度區(qū)間.在此區(qū)間內(nèi)，未凍結(jié)水的數(shù)量已經(jīng)足夠PVA分子的運動，從而形成大分子間的纏結(jié)，同時在這些類液相的區(qū)域中PVA的濃度足夠高，可以進(jìn)行強(qiáng)烈的凝膠化.所以反復(fù)冷凍／解凍法比一次冷凍／解凍所得的凝膠強(qiáng)度要高得多.為了避免反復(fù)凍融造成細(xì)胞死亡率增加，本實驗選擇只冷凍／解凍一次進(jìn)行物理交聯(lián)，與具有相同PVA濃度（如體積質(zhì)量6%PVA）的硼酸交聯(lián)微球比較，其機(jī)械強(qiáng)度高于未調(diào)硼酸p H的微球，而略低于調(diào)p H后的硼酸交聯(lián)微球.因此，在本實驗條件下當(dāng)PVA濃度固定不變時，硼酸（p H6.5）交聯(lián)法制備的微球具有較高的機(jī)械強(qiáng)度.

2.3 微球通透性

2.3.1 硼酸交聯(lián)微球的通透性

取直徑為20～40目的硼酸交聯(lián)微球進(jìn)行尿素分子的通透性測試，結(jié)果如圖3（a）所示.飽和硼酸（p H4.0）交聯(lián)的微球?qū)δ蛩胤肿拥耐ㄍ感栽? min時達(dá)擴(kuò)散平衡；而飽和硼酸（p H 6.5）交聯(lián)的微球由于交聯(lián)密度增大，通透平衡時間略有延長，約2～3 min時完全通透.

圖3 微球尿素通透性測試Fiugre 3 Test of microsphere permeability to urea

2.3.2 冷凍交聯(lián)微球的通透性

如圖3（b），冷凍交聯(lián)微球隨著聚乙烯醇濃度的增加，尿素達(dá)平衡時間略有延長，通透性逐漸降低.其中，體積質(zhì)量6%PVA為2 min，體積質(zhì)量8%PVA為2.5 min，體積質(zhì)量10%PVA為3 min.20～30目與30～40目微球通透性在實驗誤差范圍內(nèi)無差別.

微球通透性試驗表明，化學(xué)交聯(lián)法和物理交聯(lián)法制備的微球都有較好的尿素通透能力，尿素達(dá)到完全通透所需時間最長不超過3 min，完全能夠滿足使用需要.由于微球通透性與微球交聯(lián)度是一對互相對立的因素，交聯(lián)度較高的微球通透性相對較低.因此，綜合考慮，在通透性不是極低的情況下，應(yīng)優(yōu)先考慮交聯(lián)度因素，有利提高微球機(jī)械強(qiáng)度，以保證固定化脲酶菌不會因微球破裂而泄漏.

2.4 體外模擬試驗

取20～40目微球進(jìn)行尿毒癥模擬血清尿素清除試驗.結(jié)果如圖4，硼酸交聯(lián)微球（質(zhì)量體積6%PVA）中，p H 4.0的微球10 h尿素清除率為97.4%，p H 6.5的微球8 h尿素清除率為97%.由于包埋過程中菌體用量不宜過高，否則會影響微球的交聯(lián)度和機(jī)械強(qiáng)度，因此，在固定化細(xì)胞完成之后，可將微球在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h以提高微球內(nèi)部的菌體細(xì)胞數(shù)量.上述2種微球經(jīng)過24 h培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)后再進(jìn)行測試，則尿素清除率都有所提高，p H 4.0的微球8 h尿素清除率為96.8%，p H 6.5的微球6 h尿素清除率為97.2%.p H4.0微球通透性高于p H 6.5微球，尿素清除速度卻低于p H 6.5微球，說明p H4.0的硼酸對脲酶菌有所傷害.冷凍交聯(lián)微球（體積質(zhì)量8%PVA）的尿素清除率10 h為94.8%，若經(jīng)培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)后測試，則尿素清除率為8 h 97.4%，與p H 4.0的硼酸交聯(lián)微球尿素清除率接近，而低于p H 6.5的硼酸交聯(lián)微球，說明冷凍過程對脲酶菌活力也有一定傷害.

圖4 血清尿素清除試驗Figure 4 Test for plasma urea removal

3 結(jié)論

冷凍法制備的微球粒徑均一，且聚乙烯醇濃度可以設(shè)定得較高，但由于冷凍、解凍過程容易造成脲酶菌細(xì)胞傷亡，若減少凍融次數(shù)又會降低聚乙烯醇交聯(lián)度，降低微球機(jī)械強(qiáng)度.因此，綜合考慮，硼酸交聯(lián)法經(jīng)過預(yù)調(diào)p H到6.5后，所制備的體積質(zhì)量為7%PVA的微球機(jī)械強(qiáng)度高，細(xì)胞活性損失小，微球通透性能夠滿足需要，尿素清除活性最高，且硼酸交聯(lián)制備微球過程簡單，成本低，應(yīng)是醫(yī)用脲酶菌固定化的最佳選擇方案.

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Comparative study on immobilizition of urease－producing bacteria used in therapy

GAOHong，CHENMing，ZHENGJinhui

（College of Life Science，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Urease－producing bacteria used in therapy were entrapped through chemical and physical methods by use of polyvinyl alcohol as the carrier.The properties and serum urea clearance activities of two sorts of microspheres were compared.Microsphere of chemical cross－linking with boric acid p H 6.5 had higher mechanical strength and urea clearance activity than that with boric acid p H 4.0.The freeze－thawing method was employed for physical cross－linking.Microsphere of physical cross－linking had a uniform diameter distribution and good mechanical strength.Its urea clearance activity was almost equal than microsphere with boric acid p H 4.0，and slightly lower than microsphere with boric acid p H 6.5.The experiment of serum urea clearance in vitro showed that microsphere of chemical cross－linking with boric acid p H 6.5 had the highest urea clearance rate of 97%in 8 h.Urea clearance rate was evidently increased to 97.2%in 6 h if pre－culture of the microsphere was carried out for 24 h.

urease－producing bacteria；uremia；oral microsphere；immobilization；PVA

Q939.9；Q 814.2

A

1671－1114（2011）01－0066－05

2010－09－18

天津師范大學(xué)青年基金資助項目（52LE39）

高 虹（1965－），女，博士，主要從事生物技術(shù)方向的研究.E－mail：gaohong 126＠126.com

（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）