梁歌宏 宋詩鐸 孫二琳 王 哲 祁 偉

嗜麥芽窄食單胞菌生物被膜形成的體外抗菌活性研究*

梁歌宏 宋詩鐸 孫二琳 王 哲 祁 偉△

目的：研究天津地區(qū)嗜麥芽窄食單胞菌（SMA）感染與耐藥現(xiàn)狀，觀察臨床常用抗生素對其形成生物被膜后的作用效果。方法：分析臨床分離的非重復51株SMA對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素、紅霉素和磺胺甲唑8種抗生素的耐藥情況，通過建立SMA生物被膜的體外模型，測定其對生物被膜的抑制濃度（BIC），與相應抗生素的最低抑菌濃度（MIC）進行比較。通過掃描電鏡觀察抗生素作用后細菌生物被膜的形態(tài)學變化。結果：51株SMA對8種常用抗生素的耐藥率分別是13.73%、82.35%、54.90%、50.98%、70.59%、82.35%、94.12%及45.10%；其中42株SMA利用微量接種針成功建立成熟生物被膜的體外模型；菌珠形成生物被膜后，每種抗生素的耐藥菌株數(shù)和耐藥程度均大幅度增加。結論：本地區(qū)分離的SMA具有耐藥譜廣、耐藥率高特點；左氧氟沙星和頭孢哌酮/舒巴坦對SMA有較強的抗菌活性。形成生物被膜后的SMA較浮游態(tài)細菌對抗生素的耐藥程度增加。

嗜麥芽窄食單胞菌 抗藥性，微生物 微生物敏感性試驗 半數(shù)抑制濃度 生物膜 抗菌藥 顯微鏡檢查，電子,掃描 天津

嗜麥芽窄食單胞菌（SMA）是醫(yī)院獲得性感染和慢性呼吸道感染的重要病原體之一，在非發(fā)酵菌中的分離率僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌[1-2]。目前國際上對銅綠假單胞菌的生物被膜（BBF）研究較多，但對SMA-BBF的研究較少。本研究主要測定臨床常用抗生素對SMA的最低抑菌濃度（MIC）及其生物被膜抑制濃度（BIC），借助掃描電鏡觀測SMA形成生物被膜前后的結構改變，旨在為臨床合理選用抗生素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗菌株：收集2002年7月—2009年7月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院、天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院、天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院、天津市環(huán)湖醫(yī)院、天津市第三中心醫(yī)院、天津市第四中心醫(yī)院及天津市胸科醫(yī)院8家三級甲等醫(yī)院SMA，均做常規(guī)生化試驗鑒定，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸桿菌ATCC25922。（2）抗生素：左氧氟沙星（LEV）、環(huán)丙沙星（CIP）、哌拉西林（PIP）、頭孢哌酮/舒巴坦（SCF）、慶大霉素（GM）、紅霉素（ERY）及磺胺甲惡唑（SXT）標準品均購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，頭孢他啶（CAZ）標準品（葛蘭素史克制藥公司）。（3）培養(yǎng)基 ：水解酪蛋白肉湯（MHB）、普通營養(yǎng)肉湯及M-H瓊脂（MHA）均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 嗜麥芽窄食單胞菌的臨床資料及藥敏分析 分析SMA臨床株的數(shù)量、標本來源情況；采用微量肉湯稀釋法測定SMA對8種抗生素的MIC，實驗結果依據(jù)2006年版美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）判定標準進行判定。

1.3 BIC的測定 用微量接種針培養(yǎng)細菌生物被膜。將含有SMA肉湯的菌濃度調(diào)至3×1011CFU/L，稀釋100倍。取稀釋后的菌液100 μL加入96孔板中（留有空白孔），將接種針插入上述96孔中，后放入35℃孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出接種針用pH 7.3的磷酸鹽緩沖液沖洗3次。將沖洗后的接種針壓入備用的內(nèi)含8種抗生素的藥敏板中，每孔含100 μL，留有空白菌液孔，四周用封口膜密封，35℃培養(yǎng)。24 h后取出接種針再次沖洗。將沖洗后的接種針轉入含有100 μL MHB的96孔板中，四周用封口膜密閉，超聲振蕩20 min使生物被膜從接種針上完全剝離到肉湯中。移除接種針換為普通的上蓋，立即于酶標儀在620 nm波長下讀取光密度值（OD0h）。隨后將此96孔板放入35℃中孵育6 h，再次測定其相應波長下的光密度值（OD6h）。成熟BBF形成的判斷標準：空白菌液孔孵育6 h前后的平均OD差值（OD6h-OD0h）≥0.05；抗生素的BIC為低于陽性對照孔OD值10%的抗生素濃度。實驗結果依據(jù)2006年版CLSI判定標準進行判定。

1.4 掃描電鏡（SEM）鑒定細菌生物被膜的形成及形態(tài)學變化 分別取SMA菌液中培養(yǎng)24 h的硅膠膜片以及抗生素作用后的硅膠膜片，在低溫的戊二醛磷酸鹽緩沖溶液經(jīng)過固定、沖洗、脫水、置換、干燥及表面噴金鍍膜，通過SEM觀察BBF在放大1 000~20 000倍下的微觀形態(tài)。

2 結果

2.1SMA標本分離部位的來源情況 共收集51株，其中痰液39株（76.47%）、尿培養(yǎng)4株（7.84%）、支氣管灌洗液2株（3.92%）、血培養(yǎng)2株（3.92%）、咽拭子1株（1.96%）及其他標本3株（5.88%）。

2.2 對8種抗生素的藥敏實驗結果 51株SMA對8種常用抗菌藥的耐藥性分別是LEV 13.73%（7/51）、CIP 82.35%（42/51）、SCF 70.59%（36/51）、PIP 54.90%（28/51）、CAZ 50.98%（26/51）、GM 82.35%（42/51）、ERY 94.12%（48/51）、SXT45.10%（23/51）；未見對所測抗生素全部敏感的菌珠，對2種以上抗菌藥物耐藥的臨床菌47株（92.16%）。

2.3 SMA對抗生素的耐藥情況及敏感性變化 42株SMA培養(yǎng)后可形成成熟的生物被膜，對8種抗生素的耐藥情況及其相應的BIC，見表1、2。42株嗜麥芽窄食單胞菌形成生物被膜前后的MIC值和BIC值情況，見表3?？股匕霐?shù)BIC（BIC50）分別高于相應抗生素的半數(shù) MIC（MIC50）；90%BIC（BIC90）也均高于相應的90%MIC（MIC90）。

表1 42株SMA對8種抗生素的耐藥情況

表2 形成生物被膜后42株SMA對8種抗生素耐藥情況

表3 生物被膜形成前后42株SMA對8種抗生素的敏感性變化 （mg/L）

2.4 培養(yǎng)24 h硅膠膜片SMA生物被膜掃描電鏡結果 可見大量段桿狀SMA聚集成簇并分泌大量胞外多糖基質(zhì)—黏液絲狀物而彼此相聯(lián)成網(wǎng)狀結構，黏液絲間穿插著大量的細桿狀菌體，自身部分或整體被分泌的胞外基質(zhì)包裹，有些細胞處于分裂期，有些胞體處于凋亡期，見圖1。菌株空白對照表面呈不規(guī)則的波紋狀起伏，未見有細菌胞體的黏附，見圖2。

2.5 細菌生物被膜在左氧氟沙星作用下形態(tài)學的變化 在抗生素作用下，細菌生物被膜的完整結構被破壞，細菌黏附數(shù)量減少，菌體間的多糖基質(zhì)稀薄，可見部分胞體已經(jīng)處于死亡裂解態(tài)形態(tài)；空白對照硅膠膜片上BBF形態(tài)仍然完整成熟，見圖3、4。

3討論

近年來SMA已成為醫(yī)院獲得性感染的常見病原體，本研究收集51株SMA，其中39株分離自痰標本，2株來自支氣管灌洗液，表明SMA引起的感染以呼吸道為主，可能與呼吸系統(tǒng)較適于SMA寄居生長和向下呼吸道傳播感染有關，這與國外報道一致[3-5]。藥敏測定結果顯示，SMA的耐藥譜廣，耐藥率較高，且多重耐藥株常為高水平耐藥。

目前隨著臨床上生物醫(yī)學材料的廣泛使用，生物被膜相關性SMA感染也日益增多[6-7]。BBF是細菌產(chǎn)生多糖蛋白復合物將自身包繞并黏附于無活性物體或活體表面而形成，有一定立體結構。本研究采用微量接種針為載體，進行體外構建嗜麥芽窄食單胞菌的生物被膜，并且通過比較細菌胞體及其分泌物在抗生素作用前后的光密度差值變化來定量判斷耐藥情況的變化，結果證實受檢的51株SMA中有42株可形成成熟的生物被膜，掃描電鏡下證實細菌生物被膜是一個不均質(zhì)性的細胞群居體。

目前CLSI標準中微量肉湯稀釋法僅僅是對暴露的、浮游狀態(tài)的細菌所做的抗生素敏感試驗，即測定相應抗生素的MIC值。但其不能準確地評估生物被膜細菌數(shù)量以及抗生素對生物被膜細菌的敏感性，所以，其生物被膜形成的程度、定量檢測的標準與臨床感染的關系仍無法得知。本研究采用的微量接種針的形態(tài)大小直徑均相同，且在等量的菌液條件下培養(yǎng)，提供了形成相同的細菌生物被膜形態(tài)的先決條件，可以精確到相應生物被膜抑制濃度的數(shù)值,真實反映抗生素對BBF細菌的抑制濃度。根據(jù)相應的BIC值證實，形成生物被膜后，部分敏感菌株轉變?yōu)槟退幹?，細菌對每種抗生素的耐藥程度均大幅度增加；而且掃描電鏡下進一步證實細菌生物被膜在抗生素作用下，雖然成熟形態(tài)被破壞、部分胞體已經(jīng)處于死亡裂解態(tài)，但是仍可見到正常的細菌胞體，繼而再次繁殖產(chǎn)生耐藥；因此形成生物被膜，也是細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的機制之一。綜上所述，本地區(qū)分離的SMA具有耐藥譜廣、耐藥率高特點；與單個細菌相比，形成生物被膜后SMA對抗生素的耐藥程度增加。

[1]Nyc O,Matejkova J.Stenotrophomonas maltophilia:Significant con?temporary hospital pathogen-review[J].Folia Microbiol(Praha)，2010,55(3):286-294.

[2]Oliver A,Alarcon T,Caballero E,et al.Microbiological diagnosis of bronchopulmonary colonization-infection in cystic fibrosis[J].En?ferm Infecc Microbiol Clin，2009,27(2):89-104.

[3]Garcia-Castillo M,Morosini MI,Galvez M,et al.Differences in bio?film development and antibiotic susceptibility among clinical Urea?plasma urealyticum and Ureaplasma parvum isolates[J].J Antimi?crob Chemother，2008,62(5):1027-1030.

[4]Ryan RP,Fouhy Y,Garcia BF,et al.Interspecies signalling via the Stenotrophomonas maltophilia diffusible signal factor influences biofilm formation and polymyxin tolerance in Pseudomonas aerugi?nosa[J].Mol Microbiol，2008,68(1):75-86.

[5]Pompilio A,Catavitello C,Picciani C,et al.Subinhibitory concentra?tions of moxifloxacin decrease adhesion and biofilm formation of Stenotrophomonas maltophilia from cystic fibrosis[J].J Med Micro?biol，2010,59(Pt 1):76-81.

[6]Di Bonaventura G,Spedicato I,D’Antonio D,et al.Biofilm forma?tion by Stenotrophomonas maltophilia:modulation by quinolones,trimethoprim-sulfamethoxazole,and ceftazidime[J].Antimicrob Agents Chemother，2004,48(1):151-160.

[7]Di Bonaventura G,Stepanovic S,Picciani C,et al.Effect of environ?mental factors on biofilm formation by clinical Stenotrophomonas maltophilia isolates.[J].Folia Microbiol(Praha)，2007,52(1):86-90.

In Vitro Susceptibility Assay of Biofilm Formation of Stenotrophomonas Maltophilia

LIANG Gehong,SONG Shiduo,SUN Erlin，WANG Zhe,QI Wei

Institute of Infectious Diseases,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211，China

Objective:To investigate the current situation and resistance ofStenotrophomonas Maltophiliaclinical(SMA)strains collected from Tianjin area,and investigate the effects of antibiotics on the SMA biofilms.Methods:The distri?bution and drug resistant situations of 51 isolated clinical strains of SMA were analyzed.Subsequently,the model of SMA bio?films in vitro was developed,challenged by antibiotics and calculated biofilm inhibitory concentrations,and to observe the change of biofilms by scanning electron microscopy.Results:The resistance rates of SMA to 8 kinds of commonly used anti?biotics were as following:13.73%,82.35%,54.90%,50.98%,70.59%,82.35%,94.12%and 45.10%,of which,42 strains could be formed bacterial biofilms.After the formation of biofilm,the antibiotic resistance and resistance strains increased substantially.Conclusion:SMA may be one of the most important pathogenic bacteria in Tianjin area,with features of high drug resistance rate and multidrug resistance.The susceptibility test demonstrated that levofloxacin and cefoperazone/sulbac?tam had a high level of antimicrobial activity.Comparing to planktonic bacterial growth,SMA growing as biofilms proves to be highly resistant to most antimicrobials.

stenotrophomonas maltophilia drug resistance,microbial microbial sensitivity tests inhibitory con?centration 50 biofilm anti-bacterial agents microscopy,electron,scanning TIANJIN

10.3969/j.issn.0253-9896.2011.08.008

*天津市高等學?？萍及l(fā)展基金項目（項目編號：20050210）

300211 天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院感染性疾病研究所△

E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

（2010-10-29收稿 2011-01-11修回）

（本文編輯 陸榮展）