李玲，唐艷，農(nóng)皓如，林波，曾慶坤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，南寧 530001）

堿性蛋白酶制備水牛乳抗氧化活性肽酶解條件的優(yōu)化

李玲，唐艷，農(nóng)皓如，林波，曾慶坤

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，南寧 530001）

采用堿性蛋白酶，以水解度以及DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素以及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化水牛乳蛋白的酶解工藝，確定堿性蛋白酶制備水牛乳抗氧化活性肽的最佳酶解工藝為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，加酶量10 000 U/g，酶解pH值為10.5，酶解時(shí)間2.5 h，溫度為60℃；此時(shí)，酶解物水解度達(dá)30.46%±0.15%，DPPH自由基清除率達(dá)69.13%±1.22%。

堿性蛋白酶；水牛乳；抗氧化活性；多肽；酶解條件

0 引 言

乳源肽具有較強(qiáng)的生物活性，能起到抗氧化、抗菌、抗病毒、抗高血壓、抗血栓、提高免疫力等作用，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值[1]，水牛奶乳汁濃厚，品質(zhì)優(yōu)良，是制作各種高檔乳制品的良好原料。采用堿性蛋白酶酶解水牛乳蛋白，以水解度以及DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素以及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，以促進(jìn)水牛乳蛋白肽的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

水牛乳；堿性蛋白酶；DPPH；其余試劑為分析純。乳成分分析儀；pH計(jì)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；紫外分光光度計(jì)；Alpha 1-2 LD真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 方法

（1）水解度的計(jì)算采用pH-Stat[2]滴定法。

（2）DPPH清除率的計(jì)算。參考Saiga A[3-4]等人的方法，配置0.1 mmol/LDPPH無(wú)水乙醇溶液，測(cè)定加樣方法如表1所示，加樣后充分震蕩混勻，室溫下反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度值。

表1 DPPH自由基清除率測(cè)定加樣方法

（3）酶解工藝。水牛乳→乳脂分離機(jī)脫脂乳（乳脂含量＜0.5%水牛乳質(zhì)量）→HCl調(diào)pH值至4.6→沉淀酪蛋白→過濾，棄濾液→酪蛋白加少量蒸餾水清洗多次至上清液無(wú)色→用濃度為0.05 mol/L的NaOH溶液在一定溫度下溶解酪蛋白→完全溶解后→加蒸餾水調(diào)至實(shí)驗(yàn)所需酪蛋白底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并調(diào)pH值至酶解所需條件→取水牛乳酪蛋白溶液→加適量酶→在一定條件下進(jìn)行酶解→反應(yīng)中持續(xù)滴加濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液維持反應(yīng)體系pH值，并記錄水解液所需堿液體積，計(jì)算水解度→水解完成后→沸水中滅酶5 min→快速冷卻至室溫→調(diào)節(jié)溶液pH值至4.6,4 200 r/min離心，去除未被水解的酪蛋白→取上清液，調(diào)節(jié)pH值至6.8，冷凍干燥→得到多肽。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)條件

（4）單因素實(shí)驗(yàn)。以蛋白酶解物的水解度及DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酶解工藝中的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解pH、加酶量、酶解時(shí)間以及溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。在測(cè)定某一因素的最佳條件時(shí)，固定其他單因素的條件不變，單因素實(shí)驗(yàn)條件如表2所示。

（5）正交實(shí)驗(yàn)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加酶量、酶解pH值、時(shí)間和溫度作為試驗(yàn)因子，采用四因素三水平正交設(shè)計(jì)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到蛋白肽制備的最佳工藝。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以蛋白酶解物的水解度及30 mg/mL酶解物DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酶解工藝中的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解pH、加酶量、酶解時(shí)間和溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.1.1 pH值對(duì)酶解的影響

每一種酶都有其最適反應(yīng)pH值，酶對(duì)反應(yīng)體系pH的變化比較敏感，蛋白酶以及底物的蛋白隨著pH的變化表現(xiàn)出不同的解離狀態(tài)，pH值直接影響酶與底物蛋白的結(jié)合與催化活力。為確定酶解的最適pH值，酶解條件選擇pH值為8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，水解度在pH值為10.0時(shí)達(dá)到最大值28.36%，DPPH清除率為56.58%，pH值為10.5時(shí)水解度28.04%，DPPH清除率達(dá)到最大值76.74%。酶解反應(yīng)的最適pH值為10.0～11.0。

2.1.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解的影響

為確定最適底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，3%，5%，7%，9%進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。 由圖2可以看出，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，DPPH清除率低；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%以上，水解度以及DPPH清除率變化不顯著；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時(shí)，反應(yīng)液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，底物的溶解差，黏度增加，抑制蛋白質(zhì)與酶的結(jié)合，水解度迅速下降[5]。因此，高底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)有利于酶解反應(yīng)進(jìn)行，但同時(shí)過高底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)又造成溶解度降低，影響蛋白酶擴(kuò)散，對(duì)水解反應(yīng)有抑制作用，在保證較高水解度情況下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇5%。

2.1.3 加酶量對(duì)酶解的影響

為確定最適加酶量，采用加酶量2 000，4 000，6 000，8 000，1 0000，12 000U/g（底物）進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著加酶量的增加，水解度逐漸增大，加酶量大于6 000U/g后水解度增速逐漸減小。底物的水解度取決于蛋白酶的量，但當(dāng)酶分子在體系中趨于飽和后，部分酶不能和底物接觸時(shí)，水解度的提高會(huì)減慢[6]。DPPH清除率在到達(dá)8 000U/g時(shí)達(dá)到最高81.70%，隨后逐漸下降，加酶量增加至12 000U/g時(shí)，水解度僅增加0.91%。綜合考慮成本因素，確定最宜加酶量為6 000～1 0000 U/g底物。

2.1.4 時(shí)間對(duì)酶解的影響

為確定最適酶解時(shí)間，采用酶解時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，水解度以及DPPH清除率隨時(shí)間的增加逐漸增大，在3.0 h時(shí)達(dá)到最大77.88%。蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行逐步水解，首先被水解為較小的具有一定活性的肽段，隨著水解的進(jìn)行，活性肽段又進(jìn)一步過度水解為氨基酸，致部分活性消失，同時(shí)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，產(chǎn)物的大量增加，抑制了反應(yīng)的進(jìn)行[7]，3.0 h后，水解度及DPPH清除率變化小。最適宜酶解時(shí)間應(yīng)為2.5～3.5 h。

2.1.5 溫度對(duì)酶解的影響

為確定最適酶解溫度，采用溫度為40，45，50，55，60，65℃進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，40～55℃隨著溫度升高水解度及DPPH清除率逐漸增大，原因是低溫下酶的穩(wěn)定性高，但酶活低，隨著溫度的升高，酶活力增加，反應(yīng)物之間的分子間有效接觸的頻率增加。酶催化反應(yīng)在其最適溫度下，酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值。55℃后隨著溫度的不斷升高，堿性蛋白酶逐漸失活，酶解反應(yīng)出現(xiàn)了停滯現(xiàn)象，水解度和DPPH清除率不再增大。55℃條件下水解度和DPPH清除率分別達(dá)到最大值為28.91%和84.79%，最適宜的酶解溫度為50～60℃。

綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到酶解酪蛋白的單因素最佳條件：pH值為10.0～11.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，加酶量為6 000～10 000 U/g， 酶解時(shí)間為2.5～3.5 h，溫度為50～60℃。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)得到水牛乳蛋白的最佳酶解條件：pH值為10.0～11.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，加酶量為6 000～1 0000 U/g，酶解時(shí)間為2.5～3.5 h，溫度為50～60℃。設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以水解度以及質(zhì)量濃度為20g/L酶解物DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。正交因素水平如表3所示。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，由水解度作為指標(biāo)得到的極差值分析，因素的主次順序依次為時(shí)間＞加酶量＞溫度＞pH值，得到的最優(yōu)條件為A3B2C3D3。由DPPH清除率作為指標(biāo)得到的極差值分析，因素的主次順序依次為pH值＞溫度＞時(shí)間＞加酶量，pH值為11.0時(shí)，雖然DPPH自由基清除率較高，但通過方差分析多重比較顯示，與pH值為10.5條件下DPPH自由基清除率無(wú)顯著差異（P＞0.05），且酶解底物中殘留微量的乳糖，在強(qiáng)堿性以及加熱條件下發(fā)生顏色反應(yīng)，殘留的乳糖導(dǎo)致酶解液呈深黃色直至棕紅色。顏色反應(yīng)影響DPPH自由基清除率的測(cè)定，可能導(dǎo)致清除率的分析結(jié)果與真實(shí)結(jié)果有一定偏差，因?yàn)镈PPH反應(yīng)測(cè)定時(shí)顏色是由紫色變?yōu)辄S色。因此，由DPPH自由基清除率,得到的最優(yōu)條件為A3B2C1D3。綜合考慮水解度以及DPPH自由基清除率并結(jié)合操作性、經(jīng)濟(jì)因素等考慮得到最佳組合A3B2C1D3，即酶解pH值為10.5，加酶量為10 000 U/g，時(shí)間為2.5 h，溫度為60℃。

表3 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到酶解水解度為30.46%±0.15%，質(zhì)量濃度為20 g/L的DPPH，清除率為69.13%±1.22%。

3 結(jié) 論

以水牛乳為原料，選擇堿性蛋白酶對(duì)水牛乳蛋白進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，利用單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)，得到水牛乳蛋白肽的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量10 000 U/g底物、酶解pH值為10.5，時(shí)間為2.5 h，溫度為60℃。該工藝條件下得到的多肽，水解度為30.46%±0.15%，DPPH清除率為69.13%±1.22%。

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Optimizing enzymolysis conditions of antioxidant activity buffalo milk peptide with alkaline protease

LI Ling,TANG Yan,NONG Hao-ru,LIN Bo,ZENG Qing-kun
（Guangxi Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001,China）

The buffalo milk peptide was prepared with alkaline protease,enzymolysis conditions was optimized by single-factor and orthogonal tests,which were evaluated by the hydrolysis degree and DPPH scavenging rate,the result shows that：the optimun conditions are：concentration of substrate 5%,enzyme addition 10 000 U/g substrate,enzymolysis pH10.5,enzymolysis time 2.5 h,enzymolysis temperature 60℃,In this process,the hydrolysis degree and DPPH scavenging rate reach 30.46%±0.15%and 69.13%±1.22%.

alkaline protease;buffalo milk;antioxidative activity;peptide;enzymolysis conditions

TQ936.1+6獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

1001-2230（2011）12-0012-03

2011-08-15

水?；?007007）。

李玲（1984－），女，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與技術(shù)。

曾慶坤