陳佩杰,董靜梅,2

過度運動激活中性粒細胞產(chǎn)生的活性氧對淋巴細胞DNA損傷及干預(yù)研究

陳佩杰1,董靜梅1,2

目的:探討過度運動激活中性粒細胞NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的活性氧(ROS)對淋巴細胞DNA損傷的影響及實施二聯(lián)苯碘(DPI)干預(yù)作用。方法:30只雄性Vistar大鼠隨機分為3組,安靜組(C,n=10)、過度訓練組(E,n=10)和DPI干預(yù)組(D,n=10),E組和D組進行遞增負荷跑臺訓練11周,末次訓練結(jié)束后在36～40 h內(nèi)各組隨機取8只眼眶靜脈采血。應(yīng)用EL ISA方法檢測血漿細胞因子水平及血液中脂質(zhì)過氧化水平;提取白細胞用AnnexinV/PI雙染色法流式測定中性粒細胞凋亡與壞死程度;免疫細胞化學的激光共聚焦法測定NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位;單細胞凝膠電泳測定淋巴細胞的DNA損傷程度。結(jié)果:1)與C組比較,E組血漿IL-1b顯著性升高,IL-8、TNF-α顯著升高(分別為P<0.01和P<0.05),MCP-1與CINC顯著性下降(P<0.05);而D組血漿IL-1b、MCP-1顯著下降(P<0.05),IL-8、TNF-α顯著性升高(P<0.05);E組和D組大鼠血漿MDA、MPO水平均上升(分別為P<0.01和P<0.05);2)與C組相比,E組、D組中性粒細胞性凋亡的百分比均顯著上升(P<0.01),但中性粒細胞的死亡數(shù)E組增加(P<0.05)而D組無顯著變化;3)與C組比較,E組出現(xiàn)DNA損傷的彗星細胞數(shù)非常顯著性升高(P< 0.01),且彗星細胞的寬度和尾長的變化均達到顯著性水平,而D組的變化均未達到顯著性水平;4)中性粒細胞的共聚焦染色定位顯示:與安靜組對照比較,E組出現(xiàn)了NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位。結(jié)論:1)過度運動可引起外周血炎性因子和趨化分子分泌的增加,從而有可能誘發(fā)組織炎癥的發(fā)生和而調(diào)節(jié)T淋巴細胞的分化;2)過度運動可激活外周血中性粒細胞的NADPH氧化酶介導產(chǎn)生過多的ROS使血液的脂質(zhì)過氧化水平提高;3)由此途徑產(chǎn)生的ROS的增多和血液過氧化水平的提高可能引起中性粒細胞本身的凋亡甚至死亡和淋巴細胞的DNA損傷:4)由此途徑產(chǎn)生的ROS的增多、吞噬細胞及淋巴細胞的過氧化損傷、炎性因子及免疫調(diào)節(jié)因子的變化等多因素可調(diào)節(jié)細胞免疫,是過度運動引起的運動型免疫抑制的可能因素。

過度運動;中性粒細胞;活性氧;淋巴細胞;DNA損傷;干預(yù);鼠;動物實驗

1989年Nieman[14]、1994年P(guān)edersen[17]等分別通過對馬拉松后運動員上呼吸道的感染率(URTI)增多的流行病學的調(diào)查與分析提出“open window”理論和“J型曲線”來描述運動量和URTI發(fā)生率之間的關(guān)系,在此基礎(chǔ)上形成運動性免疫抑制(Exercise-induced Immunosupp ression)的理論。2004年,Lancaster GI[12]在Th1/Th2細胞二歧性理論的啟發(fā)下,通過對淋巴細胞的Th1型和Th2型及其分泌的細胞因子的研究發(fā)現(xiàn):大強度、長時間運動導致Th1/ Th2失衡,形成Thl向Th2漂移,這種失衡性抑制的突出特點表現(xiàn)在細胞免疫功能的減弱和體液免疫的增強上。至此解決運動性免疫抑制問題的關(guān)鍵所在就轉(zhuǎn)化為透徹分析過度運動導致的細胞免疫功能減弱的原因所在。在機體的免疫調(diào)節(jié)中,非特異性免疫系統(tǒng)與特異性免疫應(yīng)答,抗原提呈及TH細胞的分化密不可分,正是由于機體的非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)的有機結(jié)合才能有效地實施免疫效應(yīng)。由此以吞噬細胞(包括單核巨噬細胞和中性粒細胞)為主體,協(xié)同NK細胞及其他免疫細胞構(gòu)成的機體的非特異性免疫系統(tǒng),通過吞噬細胞的“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生的由NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的活性氧來殺死進入機體的病毒微生物[2],構(gòu)成了機體的免疫系統(tǒng)的第一道防線。筆者前期的實驗研究證明,過度運動可導致吞噬細胞呼吸爆發(fā)增加,在此過程中吞噬細胞本身由于其釋放一系列細胞防御性因子包括蛋白酶、超氧陰離子等而自身降解,而其釋放的細胞因子可調(diào)節(jié)T淋巴細胞的分化,并進一步激活NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生釋放更多的活性氧,這種由NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的活性氧是否可誘導其他免疫細胞的一系列的過氧化反應(yīng)而導致細胞的過氧化損傷,從而降低細胞免疫功能?

基于此問題的思考,本研究在Singh等[19]建立的堿性單細胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis,SCGE)又稱彗星實驗的基礎(chǔ)上,對該實驗流程進行改良,利用該實驗的高精準度的特點對過度運動后淋巴細胞DNA損傷進行測定。并在前期過度運動對中性粒呼吸爆發(fā)與吞噬功影響的基礎(chǔ)上,根據(jù)過度運動引起的NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生過度ROS的理論,利用流式細胞儀分別測定中性粒細胞與單核細胞凋亡、壞死、存活細胞比例,分析其產(chǎn)生ROS與凋亡及DNA損傷以及相關(guān)炎性因子的相關(guān)關(guān)系中,利用NADPH氧化酶的抑制劑二聯(lián)苯碘作為抗氧化干預(yù)的方法,探討淋巴DNA損傷的原因及機制,為過度運動引起的過氧化損傷及運動性免疫抑制的干預(yù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑:二聯(lián)苯碘(Diphenylene iodonium,DPI)、二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)、DAPI染色液、胎牛血清、RPM I-1640培養(yǎng)基均購自美國SIGMA公司;氮藍四唑(NBT)、臺盼藍染液(rypan Blue Stain)購自美國GIBCO公司;多型核細胞分離液(PolymorphprepTM)及淋巴細胞分離液均購自挪威AXIS-SHIELD公司。

單細胞凝膠電泳試劑:正常熔點瓊脂糖(Bio Basic Inc.)、低熔點瓊脂糖凝膠(App liChem)。細胞裂解液:2.5 mol/L NaC1,100 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris,1%肌氨酸鈉(p H 10),臨用前加1%Triton X-100,10%DM SO電泳液:300 mM NaOH,1 mM Na2EDTA,(p H 13),中和緩沖液:0.4 mol/L Tris-HC1(p H 7.5)。

試劑盒:血液中炎性因子的酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海迪奧生物科技有限公司代理的德國D&G公司產(chǎn)品,細胞凋亡試劑盒購自美國Beckman Coulter公司。單細胞電泳試劑盒購自上海上海卓康生物有限公司。細胞內(nèi)活性氧測定試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

儀器:流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)、BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、激光共聚焦顯微鏡(LSCM,德國蔡司公司)、酶標儀(美國伯樂公司):DYY-2C型電泳、DYCP-31DM型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 過度訓練模型的構(gòu)建

30只雄性Vistar大鼠(Weight 225±6.7g,購自上海BK生物技術(shù)有限公司),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(環(huán)境溫度20℃～25℃,每天光照時間保證12 h,自由飲食水)。隨機取10只作為安靜對照組(C),其余繼續(xù)進行4周的跑臺訓練(V=22.5 m/min,每天1次,每次1 h)后,隨機分單純過度運動訓練組(E,n=10)、過度訓練DPI干預(yù)組(D,n= 10),訓練方案參照巴西Campinas州立大學Hohl R的方法[8]。從第5周開始,D組在訓練前30 min腹腔注射DPI (Sigma,產(chǎn)品編號:D2926),給予劑量與方法參考[8],C組與E組按相同劑量與方法給與DPI配液的安慰劑。以觀察大鼠的刺激運動能力急劇下降為力竭標準,同時,取眼眶靜脈叢血檢測過度訓練E組大鼠的血清皮質(zhì)酮和睪酮以及血紅蛋白的顯著性降低為過度訓練模型是否成功的生化指標的標準。

表1 本研究大鼠過度運動模型建立一覽表Table 1 Protocol of Overtrain ing in Rats

1.3 血樣的采取及血漿指標的測定

11周的過度力竭訓練模型建立后,為避免運動應(yīng)激和麻醉劑對實驗結(jié)果的影響,所有大鼠均保證在末次訓練的36～40 h內(nèi)眼眶靜脈叢取血2 m l血液后立即斷頭,其中所取0.8 ml血于肝素抗凝管,3 000 rpm 5 min離心分離血漿,置-18℃保存用于血漿指標的測定,取1 ml于肝素抗凝用于中性粒細胞和單核細胞的分離。血漿指標按酶聯(lián)免疫試劑盒測得中性粒細胞趨化因子(CINC)、白介素-1β (IL-1β)、白介素-8(IL-8)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)等指標的測定,另取0.2 ml血置EDTA抗凝管,用于常規(guī)生化指標的測試。

1.4 中性粒細胞與單核細胞和淋巴細胞的提取

按多型核細胞分離液說明取分離液1 m l與離心管中,將血液小心鋪于分離液液面上后離心(450 g,35 min,18℃～22℃),取中性粒細胞與單核細胞分離層用0.45%NaCI低滲液洗2次,用PBS洗1次后加入0.4%胎盼藍染色計數(shù),調(diào)細胞濃度為1×107個/ml,活細胞數(shù)不低于96%后懸浮于預(yù)冷的適量RPM I-1640培養(yǎng)液中備用。

1.5 NADPH氧化酶活性的測定

每樣取中性粒細胞5×106個細胞懸浮于NBT溶液中(4 mg/m l),37℃水浴鍋中保濕孵育20 min,加入1M HCI終止反應(yīng),離心(2 500 rpm,5 min,18℃～22℃)后加入400μl的DMSO穩(wěn)定形成三苯基甲酯,移入酶標板在560 nm處測定吸光度(OD),OD值越大表明NADPH氧化酶活性越高。

1.6 中性粒細胞凋亡的Annexin V/PI雙染色法的流式測定

取制備好的中性粒細胞細胞懸液(1×106mL)直接收集到10 ml的離心管中,按試劑盒要求洗滌并加入熒光染料4℃下避光孵育20 min,上流式儀檢測10 000個細胞,激發(fā)波長488 nm,用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC +/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。

1.7 淋巴細胞DNA的單細胞電泳實驗

取制備好的淋巴細胞懸液用PBS洗滌一次,并調(diào)濃度為1×105個/mL。在Singh等[6]建立的堿性彗星實驗的基礎(chǔ)上,嚴格按照試劑盒的測試方法和要求在經(jīng)過制片、裂解、漂洗、解旋、電泳、漂洗、染色7個步驟,最后在熒光顯微鏡紫外光的激發(fā)下觀察觀測結(jié)果,每樣平行做2次,每樣取100個細胞觀測出現(xiàn)彗星細胞數(shù),用CASP(casp-1.2.2)軟件測量分析出現(xiàn)的彗星細胞的尾距和尾長。

1.8 統(tǒng)計方法

所有測試結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示(mean±standard),用SPSS for Windows 15.0軟件分析處理,進行單因素方差分析,測試結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示,P<0.05為具有顯著性意義,P<0.01為具有非常顯著性意義。DNA損傷分析用CASP(casp-1.2.2)軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 過度訓練模型建立的指標體系

11周跑臺訓練結(jié)束后,在末次訓練的36～40 h采血測定HB、血漿睪酮、皮質(zhì)酮等血液指標作為此次建模的指標體系,通過比較對照組與訓練組的這些指標的顯著性變化來驗證大鼠力竭訓練模型的建立是否成功,血液中各指標見表2。

表2 本研究力竭訓練建模后訓練大鼠血漿中血紅蛋白、皮質(zhì)酮和睪酮的含量變化一覽表Table 2 Changes of Hb,Cortisol,Testosterone in Blood Plasma after Overtraining(M±SD)

同安靜組相比,訓練E組建模后血漿血紅蛋白、皮質(zhì)酮和睪酮的含量均出現(xiàn)顯著性下降。

11周跑臺遞增負荷的訓練過程中大鼠體重的變化:在訓練的11周和訓練后恢復的1周中,對對照組與單純訓練組大鼠體重的變化進行跟蹤測定(圖1)。

從圖1可看出,安靜訓練組12周的建模過程中,大鼠體重均呈現(xiàn)規(guī)律的增長趨勢,前5周安靜對照組與單純訓練組的大鼠體重基本無差異均呈現(xiàn)一定的增長態(tài)勢,但進入第5周至第8周前,訓練組因為運動負荷的加大,大鼠體重顯著增長程度降低,而且在進入第8周至11周這個負荷明顯加大的力竭過度訓練期,訓練組大鼠的體重未增反降,在建模后1周的恢復期有所恢復,但與同期安靜組對比,訓練組大鼠的體重顯著性低于安靜對照組。

圖1 11周跑臺訓練過程中與1周恢復后大鼠體重的變化情況示意圖Figure1. Weight of Rat during 11-weeks Exhaustive Training and after 1-weeks Recovery

2.2 過度訓練后血液中各細胞因子指標的變化

過度訓練后36 h,取血液分離血漿Elisa試劑盒測得各細胞因子(表3)。同安靜對照組C組的單因素方差分析的結(jié)果表明(表3):過度訓練E組,在末次訓練結(jié)束后36 h血漿中IL-1b非常顯著性升高,IL-8、TNF-α達到顯著性升高,MCP-1與CINC則顯著性下降。DPI干預(yù)組同安靜對照組比較,IL-1b、MCP-1兩項指標在過度訓后顯著下降,IL-8、TNF-α兩項指標則顯著性升高。CINC與MCP-1則有不同程度的下降,但未達到統(tǒng)計學意義。

表3 本研究過度運動后大鼠血漿中細胞因子的變化情況一覽表Table 3 Changes of Cytokine in Rat Plasma after Overtraining (M±SD,n=8)

2.3 過度運動后血液過氧化物水平的變化

2.3.1 過度運動后血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)指標的測定

圖2表示,同安靜組對照組比較,單純運動組在過度訓練后36 h大鼠血漿MDA水平急劇上升達到了極其顯著性水平,D組運動后36 h也有所升高達到顯著性水平。

2.3.2 過度運動后血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物髓過氧化物酶(MPO)指標的測定

同安靜對照組比較,過度訓練后36 h單純訓練E組與D組的血漿髓過氧化物酶均升高,單因素方差分析的結(jié)果表明,E組的上升水平達到極其顯著性水平,D組達到顯著性水平(圖3)。

2.4 過度運動后中性粒細胞中NADPH氧化酶活性的測定

分離中性粒細胞對細胞中NADPH氧化酶采用化學發(fā)光法測定其OD值的結(jié)果表明(圖4),同安靜對照組比較,單純過度訓練組的OD值明顯高于安靜對照組達到顯著性水平,而D組則略有提高但未達到顯著性水平。

圖2 各組大鼠在過度訓練后36 h血漿MDA水平的變化示意圖Figure 2. Concerntration of MDA in Rat Blood Plasma after 36-hours of Overtra in ing

圖3 各組大鼠在過度訓練后36 h血漿M PO水平的變化示意圖Figure 3. Concengtion of MPO in Rat Blood Plasma after 36-hours of Overtra in ing

圖4 各組大鼠在過度訓練后36 h中性粒細胞中NADPH氧化酶活性的變化示意圖Figure 4. Activation of NADPH Oxidase in Rat Neutrophoile after 36-hours of Overtrain ing

2.5 過度運動后中性粒細胞凋亡的流式測定

圖5 過度訓練后大鼠中性粒細胞與淋巴細胞凋亡的雙染色流式細胞測定示意圖Figure 5. Apoptosis and Necrosis of Neutrophil with the Methods of Annexin V/PIDouble Staining from Flow Cytometer

圖6 過度訓練后各組大鼠中性粒細胞凋亡的百分比示意圖Figure 6. Percentage of Apoptosos Cell in Rat Neutrophoile after Overtrain ing

圖7 過度訓練后各組大鼠中性粒細胞中壞死細胞的百分比示意圖Figure 7. Percent of Dead Cell in Rat Neutrophoils after Overtraining

圖6、圖7表示,通過分離血液中白細胞后進行流式測定后發(fā)現(xiàn),過度訓練后D組與E組大鼠中性粒細胞與凋亡率與死亡率均明顯高于安靜對照組,單因素方差分析表明,E組達到極其顯著性水平,而D組達到顯著性水平。

2.6 過度運動后對淋巴細胞DNA損傷的單細胞電泳實驗

圖8為過度運動后36 h取血樣分離淋巴細胞進行的單細胞電泳實驗,該實驗是一種較為成熟的檢測細胞DNA損傷的技術(shù)。當DNA損傷時通過單細胞電泳可觀察到出現(xiàn)類似“彗星”尾巴的細胞出現(xiàn)。DNA在電泳中移動的程度直接反映DNA分子的損傷程度,可用軟件測量彗星細胞的寬度和尾巴的長度來分析損傷的程度。圖8是選擇最具有代表性DNA損傷程度的細胞熒光圖,其中,A圖顯示基本未有DNA損傷的細胞電泳的結(jié)果,B圖為輕度的淋巴細胞DNA損傷的電泳結(jié)果示圖,C圖為DNA損傷很嚴重的細胞。

圖8 淋巴細胞DNA損傷的最具有代表性的彗星細胞示意圖(200)Figure 8. DNA Damage of Lymph Cell from SCGE Experiment(200) (A is no injury l,B is a little DNA injured and C is critical DNA injured in cell)

每樣去100個細胞進行檢測出現(xiàn)彗星細胞的百分比,并對彗星細胞的長度和寬度進行測量分析(表4):C組、D組與E組每100個細胞平均出現(xiàn)彗星細胞的百分率分別為8.33%、12.15%和21.52%。通過對其彗星細胞的長度和寬度的測量并進行單因素方差分析的結(jié)果表明,同安靜組比較,E組出現(xiàn)彗星的細胞數(shù)遠遠大于安靜組并達到極其顯著性水平,且無論是彗星細胞的寬度和尾長均明顯大于安靜組,均達到顯著性水平,而D組同安靜組相比雖大于安靜組但均未達到顯著性水平。

2.7 過度運動后對中性粒細胞的NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位的免疫化學的激光共聚焦實驗

為了從分子水平上取得過度運動對中性粒細胞NADPH氧化的激活的證明,采用激光共聚焦與細胞免疫化學相結(jié)合的技術(shù),對過度運動后大鼠的中性粒細胞NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91phox與p47phox進行了共定位,觀察了NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基p47phox在激活時由胞質(zhì)移位到胞膜與胞膜關(guān)鍵亞基gp91phox的共融合定位。

圖9是對照安靜組中性粒細胞的關(guān)鍵亞基的p47phox和gp91phox以及核染色的圖片,其中,藍色為核染色,綠色為p47phox染色,紅色為gp91phox染色,把這3個圖片融合到一起發(fā)現(xiàn)在胞膜上未出現(xiàn)黃色的染色,說明p47phox未移位到胞膜上(圖9)。而圖10的過度訓練后提取的中性粒細胞的染色定位圖示融合的圖片的胞膜上出現(xiàn)了黃色的融合染色,說明p47phox已移位到胞膜與gp91phox結(jié)合(圖10)。

3 討論

3.1 過度訓練模型的成功建立

該實驗的基礎(chǔ)是建立一個成功的過度訓練模型,此次模型是通過參考Hohl R過度訓練模型的基礎(chǔ)上進行了一定的修改,通過檢測大鼠的運動能力、體力精神狀態(tài)、監(jiān)控體重變化、測定血紅蛋白、皮質(zhì)酮及睪酮的變化來全面衡量大鼠的機體狀態(tài)等幾方面來成功建模的。該訓練模型的特點是:1)建模時間長,從適應(yīng)到遞增負荷要歷時12周,可達到運動對大鼠機體刺激更深刻;2)前期的適應(yīng)性訓練歷時4周,可使不同體質(zhì)狀態(tài)的大鼠都能達到一個良好的適應(yīng)狀態(tài);3)遞增負荷以不增加跑臺的速度而增加訓練的頻次來實現(xiàn),此法一個顯著優(yōu)點是可使大鼠損傷小而恢復快,這次建模因意外死亡的大鼠只有2只,另外,多次刺激可使運動負荷加大,對大鼠產(chǎn)生的刺激更深入。

表4 本研究單細胞凝膠電泳檢測淋巴細胞DNA損傷結(jié)果一覽表Table 4 Results for DNA Injury of Lymphocyte Detected by SCGE

圖9 對照組C大鼠中性粒細胞的NADPH氧化酶gp91phox與p47phox的共定位(×200)Figure 9. Co-localization between the gp91phox and p47phox of the NADPH-oxidase Subun ite in Control Group C Using Immunocytochem istry and Confocal M icroscopy(×200)

圖10 訓練E組大鼠中性粒細胞的NADPH氧化酶gp91phox與p47phox的共定位(×200)Figure10. Co-localization between the gp91phox and p47phox of the NADPH-oxidase Subunite in Group E Using Immunocytochem istry and Confocal M icroscopy(×200)

3.2 過度運動對吞噬細胞和淋巴細胞分泌激活有關(guān)的細胞免疫的調(diào)節(jié)的影響

在機體的免疫活動中,免疫細胞受機體多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié),其中,IL-1β是一種強烈的炎癥細胞因子,除可調(diào)節(jié)T細胞和B細胞介導的免疫功能外,還作用于中性粒細胞和巨噬細胞及血管內(nèi)皮細胞。

TNF-α則由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生,能殺傷和抑制腫瘤細胞的細胞因子。促進中性粒細胞吞噬,抗感染,引起發(fā)熱,誘導肝細胞急性期蛋白合成,促進髓樣白血病細胞向巨噬細胞分化,促進細胞增殖和分化,是重要的炎癥介質(zhì),并參與某些自身免疫病的病理損傷[11]。

IL-8是在腫瘤壞死因子等的刺激下,由單核細胞及巨噬細胞產(chǎn)生,激活中性粒細胞產(chǎn)生兩種反應(yīng):一是,促進細胞溶酶體的釋放和呼吸爆發(fā),形成超氧化物和過氧化氫;二是,有利于對病原微生物的吞噬。同時,IL-8為中性粒細胞游走因子,能刺激蛋白酶釋放。有研究證明,大鼠的中性粒細胞化學趨化性細胞因子(CINC)相當于IL-8[21]。

MCP-1具有誘導單核細胞趨化和激活單核細胞的雙重功能,MCP-1作為主要的單核細胞趨化因子,不但對單核巨噬細胞具有雙重作用,而且,對T淋巴細胞也具有類似的作用,MCP-1是由多種細胞產(chǎn)生,包括巨噬細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞免等生成的趨化因子,其中,IL-1、TNF-α、IL-4能促進它的表達,缺乏MCP-1的小鼠T細胞應(yīng)答明顯降低,特別是Th2細胞應(yīng)答,表明MCP-1在T細胞分化中具有重要作用,可影響T細胞在多階段的分化過程[18]。

上述所選測的這些免疫調(diào)節(jié)因子,無一不是對中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞的細胞免疫具有調(diào)節(jié)作用。通過同安靜對照組的比較發(fā)現(xiàn),過度訓練引起這些免疫調(diào)節(jié)因子的表達不同程度的增加,因此,可提示過度運動可誘導中性粒細胞、單核細胞的活化促進中性粒細胞單核細胞的吞噬作用,是中性粒細胞向組織細胞侵潤增加并誘發(fā)組織細胞炎癥的發(fā)生。同時,這些免疫調(diào)節(jié)因子可增加Th2細胞應(yīng)答,誘導Th0細胞分化時由Th1向Th2細胞的漂移,運動后機體免疫力的下降和感染率的上升主要和Th1型反應(yīng)受抑有關(guān),體液免疫功能變化不大。這和之前Gomez M D(2009年)[7]報道的運動引起的免疫調(diào)節(jié)失衡導致細胞免疫減弱的結(jié)果相吻合。

3.3 過度運動對NADPH氧化酶與MPO激活及活性氧的產(chǎn)生所致的外周血過氧化水平的變化

NADPH氧化酶是調(diào)節(jié)吞噬細胞ROS產(chǎn)生的特殊功能酶,活化后的NADPH氧化酶以NADPH為遞氫體,催化反應(yīng):NADPH+2O2→NADP++H++2O-2,O-2在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下生成H2O2[4]。在中性粒細胞的嗜天青顆粒中存在著髓過氧化物酶(MPO),在有氯化物存在的條件下,該酶可將H2O2還原生成次氯酸HOCL·,HOCL·是強氧化劑和殺菌因子。測定中性粒細胞所特有的酶——MPO被認為是一個較好的反映中性粒細胞活性的指標[23]。中性粒細胞被激活后,可以脫顆粒而將MPO釋放到細胞外,MPO具有強力的感染后特征可引起其他細胞組織的損傷。

測定過度運動訓練后中性粒NADPH氧化酶的活性、血漿MPO的表達及血漿反映脂質(zhì)過氧化水平MDA的濃度,并與安靜對照組和DPI干預(yù)組對比發(fā)現(xiàn),過度運動訓練后,中性粒細胞NADPH氧化酶活性顯著增加,血漿MPO的濃度增加,血漿MDA濃度顯著增加,說明過度運動可使中性粒細胞激活通過NADPH氧化酶的激活來釋放大量的活性氧和MPO,以此誘導呼吸爆發(fā)和吞噬的免疫反應(yīng),而引起血液的脂質(zhì)的過氧化水平增加。

3.4 過度運動使中性粒細胞NADPH氧化酶激活的共聚焦的蛋白共定位的直接證據(jù)

圖11顯示,NADPH氧化酶未激活時其亞基p47phox、p40phox、p67phox位于胞質(zhì)中,而當其激活時則移位到胞膜上與胞膜上的亞基結(jié)合,這是NADPH氧化酶激活的直接證據(jù)。

圖11 NADPH氧化酶在激活與非激活狀態(tài)時各亞基的定位示意圖[22]Figure 11. Location of Subun ite of NADPH Oxidase druing Inactive and Active

因此,本研究采用“免疫細胞化學和激光共聚焦顯微掃描(Immunostaining and confocal laser-scanning microscopy)”技術(shù),這是目前國際上研究蛋白遷移和定位的最先進的技術(shù)之一[5]。根據(jù)研究的結(jié)果顯示,過度運動后中性粒細胞NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基p47phox移位至胞膜與gp91phox結(jié)合,而DPI組由于實施了對訓練大鼠進行NADPH氧化酶的抑制劑的干預(yù),則未明顯的出現(xiàn)中性粒細胞的NADPH氧化酶的蛋白移位的結(jié)果。此實驗有力證明了過度運動可激活中性粒細胞NADPH氧化酶,由此引發(fā)中性粒細胞的呼吸爆發(fā),從而釋放大量的活性氧進入血液,這與本研究測定的血漿MDA水平的升高相吻合。

3.5 過度運動對中性粒細胞Annexin V/PI雙染色法的流式細胞術(shù)

Annexin V/PI雙染色法的流式細胞術(shù)是適合于懸浮細胞早期凋亡檢測靈敏度很高的方法,本研究利用FITC與PI雙染色對死亡細胞液有一個很好的檢測,因為吞噬細胞在呼吸爆發(fā)后釋放大量的活性氧及溶酶體后即死亡,而本研究結(jié)合運動的連續(xù)性和應(yīng)激性的特點,使得在過度運動后36 h取樣合并此種方法的利用避免了機體對運動應(yīng)激刺激和對死亡細胞的檢測來反映過度運動對中性粒細胞的凋亡的影響。本實驗研究的結(jié)果表明,過度運動可導致中性粒細胞的凋亡和死亡細胞數(shù)明顯增加,而DPI組中性粒細胞的凋亡數(shù)和死亡細胞數(shù)較過度運動組有所減少。說明過度運動引起的中性粒細胞的激活使其NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的活性氧,可能是中性粒細胞產(chǎn)生活性氧的主要來源,但不排除運動引起的其他途徑活性氧的產(chǎn)生。而合并檢測的過度運動后大鼠血液中MDA的濃度的升高實驗結(jié)果表明,此途徑產(chǎn)生的過多的ROS可能是使血液中過氧化水平的提高的主要原因。

3.6 過度運動后淋巴細胞DNA損傷的彗星實驗

彗星實驗是一種較為成熟的檢測細胞DNA損傷的技術(shù)。細胞DNA在電泳中移動的程度直接反映DNA分子的損傷程度。這種技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物監(jiān)測、遺傳毒理學研究等多個領(lǐng)域[13]。彗星試驗方法原理的核心是檢測有核細胞的DNA損傷情況。粒細胞主要在組織中發(fā)揮作用,在血流中停留較短時間后衰老死亡。而淋巴細胞往返于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi),可增殖、分化,壽命數(shù)月,有的長達1年以上。因此,利用這種方法測定了過度運動后淋巴細胞DNA損傷情況。實驗表明,過度訓練后,單純訓練組淋巴細胞凋亡數(shù)顯著增加,根據(jù)凋亡嚴重程度的測量凋亡細胞的尾長和尾寬的結(jié)果也顯示,單純訓練組大鼠的淋巴細胞DNA損傷的程度要明顯高于安靜組, DPI組大鼠的淋巴細胞的DNA損傷程度數(shù)和程度也高于安靜組。

3.7 過度運動引起的中性粒細胞呼吸爆發(fā)釋放的活性氧對淋巴細胞DNA損傷的可能機制

本次實驗通過單細胞電泳實驗對過度運動后淋巴細胞DNA損傷的檢測以及應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑DPI作為對照實驗發(fā)現(xiàn),DPI組大鼠的淋巴細胞DNA損傷程度低于過度訓練組,說明過度運動引起的中性粒細胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS是導致外周血淋巴細胞DNA損傷的可能機制。因為,過度運動引起的中性粒細胞的呼吸爆發(fā)由NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的活性氧釋放入血,不但可導致血液的脂質(zhì)過氧化,還會引起血液中其他細胞的一系列過氧化反應(yīng)。有研究證明,自由基對DNA具有損傷作用[6],自由基可引起細胞內(nèi)DNA的氫鏈斷裂、堿基降解和主鏈解旋,所有核酸成分均可受到自由基的攻擊,這種損傷可被一些特殊機制修復,但也可造成永久性損傷。所以,當細胞DNA受損傷時,可造成細胞生物學活性改變,甚至導致基因突變、腫瘤與細胞死亡。但由于DPI干預(yù)組的DNA損傷也高于安靜對照組,說明中性粒細胞NADPH氧化酶途徑不是血液中ROS產(chǎn)生的惟一途徑,而通過文獻查詢可知,其他途徑產(chǎn)生的過氧化物及過度運動引起的血液中炎性因子和趨化因子增多又可作為激活NADPH氧化酶的新途徑[1,16]。因此,1)過度運動時其他途徑的活性氧對DNA的損傷;2)過度運動時炎性因子對DNA的直接損傷;3)過度運動激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS,同時,1)、2)途徑的產(chǎn)物過氧化氫和細胞因子又可激活NADPH酶產(chǎn)生更多的ROS。因此,這3個途徑的聯(lián)合作用是過度運動導致免疫細胞DNA損傷的可能機理(圖12)。

圖12 過度運動引起的ROS的產(chǎn)生途徑及對淋巴細胞的過氧化損傷示意圖Figure 12. Pathway of ROS and the Peroxidation Injury of Lymph Cell Induced by Overtrain ing

3.8 過度運動引起的細胞免疫減弱的原因透析

圖13 NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的ROS對運動性免疫抑制影響的理論機制示意圖Figure 13. The Effect of Ras on Exercise-Induced Imm unosuppression Caused by NADPH Oxidase

如圖13所示,過度運動時吞噬細胞的呼吸爆發(fā)將引起細胞的氧化脅迫,NADPH氧化酶過度激活,同時,細胞其他途徑產(chǎn)生的H2O2增加對NADPH氧化酶的正反饋刺激;加之過氧化應(yīng)激導致炎性細胞因子的釋放等3個方面使細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生急劇上升,打破了ROS的平衡狀態(tài)[15,20]。一方面,過量的ROS通過間接損傷DNA、類脂和蛋白或是直接通過ROS介導激活信號通路來誘導細胞凋亡[10];或使單核巨嗜細胞內(nèi)的AMPK失活,從而中斷了蛋白酪氨酸磷酸化而使細胞死亡而導致吞噬細胞的非特異性細胞免疫功能減弱[3];另一方面,吞噬細胞通過參與、分泌趨化因調(diào)節(jié)T細胞的分化而減弱了T細胞的功能,加之過量活性氧的產(chǎn)生本身對淋巴細胞DNA的損傷造成細胞生物學活性改變,甚至導致基因突變、腫瘤以及淋巴細胞的死亡而導致機體的特異性免疫功能減弱,表現(xiàn)為以吞噬細胞為主體的非特異性細胞免疫和T細胞為主體的特異性細胞免疫降低。

4 結(jié)論

1.過度運動可激活外周血中性粒細胞的NADPH氧化酶產(chǎn)生氧化呼吸爆發(fā),而產(chǎn)生過多的ROS使血液的脂質(zhì)過氧化水平提高。

2.過度運動可引起外周血炎性因子和趨化分子分泌的增加,從而有可能誘發(fā)組織炎癥的發(fā)生和T淋巴細胞的分化而影響Th1/Th2平衡的免疫調(diào)節(jié),導致細胞免疫的減弱。

3.過度運動激活中性粒細胞NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的ROS可引起中性粒細胞本身的凋亡甚至死亡,并引起淋巴細胞的DNA損傷。

3.過度運動激活中性粒細胞NADPH氧化酶產(chǎn)生過多的ROS可引起外周血脂質(zhì)過氧化水平的上調(diào),而吞噬細胞及淋巴細胞的損傷、炎性因子的大量分泌及免疫調(diào)節(jié)因子等眾多因素,是運動型免疫抑制的可能因素。

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Research on DNA Damage of Lymphocytes Induced by ROSMediated by NADPH-Oxidase in Neutrophils and Intervention after Overtrain ing

CHEN Pei-jie1,DONG Jing-mei1,2

Objective:To investigate the effects of reactive oxygen species(ROS)mediated by NADPH-oxidase in neutrophils and intervention of biphenyl iodide(DPI)on DNA damage of lymp hocytes induced by over training.M ethods:30 male vistar rats were random ly divided into three groups:blank control group(C,n=10),overtraining group(E,n=10)and DPI intervention group(G,n=10).Group E and G were training in standard treadmill w ith an increasing load fo r 11 weeks,w ithin 36h-40h after the last training,eight rats w ere random ly pick out f rom each group and the orbital venous blood w ere obtained.EL ISA was used to detect the level of cytokine and blood lipid peroxidation in blood p lasma.U tilizing flow cytometer and AnnexinV/PI double staining to measure the apoptosis and necrosis of neutrophil,using immunocytochemistry and confocal microscopy to indentify the co-localization bo th gp91phox and p47phox,w hich is the key subunits of the NADPH-oxidase and single cell gel electrophoresis(SCGE)was used to detect DNA damage of lymphocytes.Results:1.Compared with group C,the concentration of IL-1b,IL-8,TNF-αwere significantly increased and the MCP-1,CINC w ere significantly decreased in rat blood plasma of group E(respectively,P<0.01 andP<0.05);the concentration of IL-1b,MCP-1 w ere decreased significantly(P<0.05), and IL-8,TNF-αwere significantly increased(P<0.05)in rat blood plasma of group D;the level of MDA,M PO were increased in p lasma of group E and D(respectivelyP<0.01 andP<0.05).2.Compared with group C,the percentage of apop tosis of neutrophils significantly increased(P<0.01)in group E and D,and the percentage of cell death increased in groups E (P<0.05)w hile no significant change in group D.3.Compared w ith group C,the number of comet cells,w hich indicate the DNA damage significantly increased(P<0.01)and the w idth and the tail length of comet cells w ere significant increased in group E w hile no increase in group D.4.the co-location confocal of gp91phox and p47phoxhe,a key subunit of NADPH oxidase was localized disp lay in group E w hile no location in group C.Conclusion:1.Excessive exercise can lead to the upgrade of inflammatory cytokines and chemokines in peripheral blood, w hich may induce tissue inflammation and regulate the differentiation of T lymphocytes.2.O-vertraining can activate NADPH oxidase of peripheral blood neutrophils w hich can mediate to p roduce too much ROS and lead to the lipid peroxidation in blood.3.The p roduction of ROS from these pathway and upgrade of the levels of peroxide can cause apoptosis o r death of neutrophils and DNA damage of lymph cell.4 Too much ROS generated by this pathway in the phagocytic cells,the upgrade of inflammatory cytokines,imm une regulato ry facto rs and the peroxidation injury of lymph cell that all induced by overtraining can regulate cellular immune function,w hich may be the facto rs caused by exercise-induced immunosupp ression.

overtraining;neutrophils;radical oxygen species(ROS);lym phocy te;DNA injury;intervention;rat;animal experiment

G804.5

A

2010-08-30;

2010-12-10

國家自然科學基金資助項目(30971422);上海市重點學科建設(shè)資助項目(S30802)。

陳佩杰(1962-),男,浙江舟山人,教授,博士,博士研究生導師,研究方向為運動與免疫,Tel:(021)51253626,E-mail:chengpjk@online.sh.cn;董靜梅(1969-),女,甘肅慶陽人,副教授,在讀博士研究生,研究方向為運動與免疫,Tel:(021)35080378,E-mail:lzdjm119@sohu.com。

1.上海體育學院運動科學學院,上海200438;2.蘭州城市學院體育學院,甘肅蘭州730070

1.School of Kinesiology,Shanghai University of Spo rt, Shanghai 200438,China;2.School of Physical Education,Lanzhou City University,Lanzhou 730070,China.

1000-677X(2011)01-0029-10