陳佩杰,董靜梅,2

過度運(yùn)動(dòng)激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧對(duì)淋巴細(xì)胞DNA損傷及干預(yù)研究

陳佩杰1,董靜梅1,2

目的:探討過度運(yùn)動(dòng)激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧(ROS)對(duì)淋巴細(xì)胞DNA損傷的影響及實(shí)施二聯(lián)苯碘(DPI)干預(yù)作用。方法:30只雄性Vistar大鼠隨機(jī)分為3組,安靜組(C,n=10)、過度訓(xùn)練組(E,n=10)和DPI干預(yù)組(D,n=10),E組和D組進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練11周,末次訓(xùn)練結(jié)束后在36～40 h內(nèi)各組隨機(jī)取8只眼眶靜脈采血。應(yīng)用EL ISA方法檢測(cè)血漿細(xì)胞因子水平及血液中脂質(zhì)過氧化水平;提取白細(xì)胞用AnnexinV/PI雙染色法流式測(cè)定中性粒細(xì)胞凋亡與壞死程度;免疫細(xì)胞化學(xué)的激光共聚焦法測(cè)定NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位;單細(xì)胞凝膠電泳測(cè)定淋巴細(xì)胞的DNA損傷程度。結(jié)果:1)與C組比較,E組血漿IL-1b顯著性升高,IL-8、TNF-α顯著升高(分別為P<0.01和P<0.05),MCP-1與CINC顯著性下降(P<0.05);而D組血漿IL-1b、MCP-1顯著下降(P<0.05),IL-8、TNF-α顯著性升高(P<0.05);E組和D組大鼠血漿MDA、MPO水平均上升(分別為P<0.01和P<0.05);2)與C組相比,E組、D組中性粒細(xì)胞性凋亡的百分比均顯著上升(P<0.01),但中性粒細(xì)胞的死亡數(shù)E組增加(P<0.05)而D組無顯著變化;3)與C組比較,E組出現(xiàn)DNA損傷的彗星細(xì)胞數(shù)非常顯著性升高(P< 0.01),且彗星細(xì)胞的寬度和尾長(zhǎng)的變化均達(dá)到顯著性水平,而D組的變化均未達(dá)到顯著性水平;4)中性粒細(xì)胞的共聚焦染色定位顯示:與安靜組對(duì)照比較,E組出現(xiàn)了NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位。結(jié)論:1)過度運(yùn)動(dòng)可引起外周血炎性因子和趨化分子分泌的增加,從而有可能誘發(fā)組織炎癥的發(fā)生和而調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化;2)過度運(yùn)動(dòng)可激活外周血中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生過多的ROS使血液的脂質(zhì)過氧化水平提高;3)由此途徑產(chǎn)生的ROS的增多和血液過氧化水平的提高可能引起中性粒細(xì)胞本身的凋亡甚至死亡和淋巴細(xì)胞的DNA損傷:4)由此途徑產(chǎn)生的ROS的增多、吞噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的過氧化損傷、炎性因子及免疫調(diào)節(jié)因子的變化等多因素可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,是過度運(yùn)動(dòng)引起的運(yùn)動(dòng)型免疫抑制的可能因素。

過度運(yùn)動(dòng);中性粒細(xì)胞;活性氧;淋巴細(xì)胞;DNA損傷;干預(yù);鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1989年Nieman[14]、1994年P(guān)edersen[17]等分別通過對(duì)馬拉松后運(yùn)動(dòng)員上呼吸道的感染率(URTI)增多的流行病學(xué)的調(diào)查與分析提出“open window”理論和“J型曲線”來描述運(yùn)動(dòng)量和URTI發(fā)生率之間的關(guān)系,在此基礎(chǔ)上形成運(yùn)動(dòng)性免疫抑制(Exercise-induced Immunosupp ression)的理論。2004年,Lancaster GI[12]在Th1/Th2細(xì)胞二歧性理論的啟發(fā)下,通過對(duì)淋巴細(xì)胞的Th1型和Th2型及其分泌的細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn):大強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致Th1/ Th2失衡,形成Thl向Th2漂移,這種失衡性抑制的突出特點(diǎn)表現(xiàn)在細(xì)胞免疫功能的減弱和體液免疫的增強(qiáng)上。至此解決運(yùn)動(dòng)性免疫抑制問題的關(guān)鍵所在就轉(zhuǎn)化為透徹分析過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞免疫功能減弱的原因所在。在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中,非特異性免疫系統(tǒng)與特異性免疫應(yīng)答,抗原提呈及TH細(xì)胞的分化密不可分,正是由于機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)的有機(jī)結(jié)合才能有效地實(shí)施免疫效應(yīng)。由此以吞噬細(xì)胞(包括單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)為主體,協(xié)同NK細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞構(gòu)成的機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng),通過吞噬細(xì)胞的“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生的由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧來殺死進(jìn)入機(jī)體的病毒微生物[2],構(gòu)成了機(jī)體的免疫系統(tǒng)的第一道防線。筆者前期的實(shí)驗(yàn)研究證明,過度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)增加,在此過程中吞噬細(xì)胞本身由于其釋放一系列細(xì)胞防御性因子包括蛋白酶、超氧陰離子等而自身降解,而其釋放的細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化,并進(jìn)一步激活NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生釋放更多的活性氧,這種由NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的活性氧是否可誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞的一系列的過氧化反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞的過氧化損傷,從而降低細(xì)胞免疫功能?

基于此問題的思考,本研究在Singh等[19]建立的堿性單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis,SCGE)又稱彗星實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)該實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行改良,利用該實(shí)驗(yàn)的高精準(zhǔn)度的特點(diǎn)對(duì)過度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行測(cè)定。并在前期過度運(yùn)動(dòng)對(duì)中性粒呼吸爆發(fā)與吞噬功影響的基礎(chǔ)上,根據(jù)過度運(yùn)動(dòng)引起的NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生過度ROS的理論,利用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞凋亡、壞死、存活細(xì)胞比例,分析其產(chǎn)生ROS與凋亡及DNA損傷以及相關(guān)炎性因子的相關(guān)關(guān)系中,利用NADPH氧化酶的抑制劑二聯(lián)苯碘作為抗氧化干預(yù)的方法,探討淋巴DNA損傷的原因及機(jī)制,為過度運(yùn)動(dòng)引起的過氧化損傷及運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的干預(yù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑:二聯(lián)苯碘(Diphenylene iodonium,DPI)、二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)、DAPI染色液、胎牛血清、RPM I-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司;氮藍(lán)四唑(NBT)、臺(tái)盼藍(lán)染液(rypan Blue Stain)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;多型核細(xì)胞分離液(PolymorphprepTM)及淋巴細(xì)胞分離液均購(gòu)自挪威AXIS-SHIELD公司。

單細(xì)胞凝膠電泳試劑:正常熔點(diǎn)瓊脂糖(Bio Basic Inc.)、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(App liChem)。細(xì)胞裂解液:2.5 mol/L NaC1,100 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris,1%肌氨酸鈉(p H 10),臨用前加1%Triton X-100,10%DM SO電泳液:300 mM NaOH,1 mM Na2EDTA,(p H 13),中和緩沖液:0.4 mol/L Tris-HC1(p H 7.5)。

試劑盒:血液中炎性因子的酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自上海迪奧生物科技有限公司代理的德國(guó)D&G公司產(chǎn)品,細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。單細(xì)胞電泳試劑盒購(gòu)自上海上海卓康生物有限公司。細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

儀器:流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)、BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、激光共聚焦顯微鏡(LSCM,德國(guó)蔡司公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司):DYY-2C型電泳、DYCP-31DM型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 過度訓(xùn)練模型的構(gòu)建

30只雄性Vistar大鼠(Weight 225±6.7g,購(gòu)自上海BK生物技術(shù)有限公司),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(環(huán)境溫度20℃～25℃,每天光照時(shí)間保證12 h,自由飲食水)。隨機(jī)取10只作為安靜對(duì)照組(C),其余繼續(xù)進(jìn)行4周的跑臺(tái)訓(xùn)練(V=22.5 m/min,每天1次,每次1 h)后,隨機(jī)分單純過度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組(E,n=10)、過度訓(xùn)練DPI干預(yù)組(D,n= 10),訓(xùn)練方案參照巴西Campinas州立大學(xué)Hohl R的方法[8]。從第5周開始,D組在訓(xùn)練前30 min腹腔注射DPI (Sigma,產(chǎn)品編號(hào):D2926),給予劑量與方法參考[8],C組與E組按相同劑量與方法給與DPI配液的安慰劑。以觀察大鼠的刺激運(yùn)動(dòng)能力急劇下降為力竭標(biāo)準(zhǔn),同時(shí),取眼眶靜脈叢血檢測(cè)過度訓(xùn)練E組大鼠的血清皮質(zhì)酮和睪酮以及血紅蛋白的顯著性降低為過度訓(xùn)練模型是否成功的生化指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 本研究大鼠過度運(yùn)動(dòng)模型建立一覽表Table 1 Protocol of Overtrain ing in Rats

1.3 血樣的采取及血漿指標(biāo)的測(cè)定

11周的過度力竭訓(xùn)練模型建立后,為避免運(yùn)動(dòng)應(yīng)激和麻醉劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,所有大鼠均保證在末次訓(xùn)練的36～40 h內(nèi)眼眶靜脈叢取血2 m l血液后立即斷頭,其中所取0.8 ml血于肝素抗凝管,3 000 rpm 5 min離心分離血漿,置-18℃保存用于血漿指標(biāo)的測(cè)定,取1 ml于肝素抗凝用于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的分離。血漿指標(biāo)按酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)得中性粒細(xì)胞趨化因子(CINC)、白介素-1β (IL-1β)、白介素-8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)等指標(biāo)的測(cè)定,另取0.2 ml血置EDTA抗凝管,用于常規(guī)生化指標(biāo)的測(cè)試。

1.4 中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的提取

按多型核細(xì)胞分離液說明取分離液1 m l與離心管中,將血液小心鋪于分離液液面上后離心(450 g,35 min,18℃～22℃),取中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞分離層用0.45%NaCI低滲液洗2次,用PBS洗1次后加入0.4%胎盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,活細(xì)胞數(shù)不低于96%后懸浮于預(yù)冷的適量RPM I-1640培養(yǎng)液中備用。

1.5 NADPH氧化酶活性的測(cè)定

每樣取中性粒細(xì)胞5×106個(gè)細(xì)胞懸浮于NBT溶液中(4 mg/m l),37℃水浴鍋中保濕孵育20 min,加入1M HCI終止反應(yīng),離心(2 500 rpm,5 min,18℃～22℃)后加入400μl的DMSO穩(wěn)定形成三苯基甲酯,移入酶標(biāo)板在560 nm處測(cè)定吸光度(OD),OD值越大表明NADPH氧化酶活性越高。

1.6 中性粒細(xì)胞凋亡的Annexin V/PI雙染色法的流式測(cè)定

取制備好的中性粒細(xì)胞細(xì)胞懸液(1×106mL)直接收集到10 ml的離心管中,按試劑盒要求洗滌并加入熒光染料4℃下避光孵育20 min,上流式儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光,另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,為(FITC +/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。

1.7 淋巴細(xì)胞DNA的單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)

取制備好的淋巴細(xì)胞懸液用PBS洗滌一次,并調(diào)濃度為1×105個(gè)/mL。在Singh等[6]建立的堿性彗星實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,嚴(yán)格按照試劑盒的測(cè)試方法和要求在經(jīng)過制片、裂解、漂洗、解旋、電泳、漂洗、染色7個(gè)步驟,最后在熒光顯微鏡紫外光的激發(fā)下觀察觀測(cè)結(jié)果,每樣平行做2次,每樣取100個(gè)細(xì)胞觀測(cè)出現(xiàn)彗星細(xì)胞數(shù),用CASP(casp-1.2.2)軟件測(cè)量分析出現(xiàn)的彗星細(xì)胞的尾距和尾長(zhǎng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

所有測(cè)試結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±standard),用SPSS for Windows 15.0軟件分析處理,進(jìn)行單因素方差分析,測(cè)試結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為具有顯著性意義,P<0.01為具有非常顯著性意義。DNA損傷分析用CASP(casp-1.2.2)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 過度訓(xùn)練模型建立的指標(biāo)體系

11周跑臺(tái)訓(xùn)練結(jié)束后,在末次訓(xùn)練的36～40 h采血測(cè)定HB、血漿睪酮、皮質(zhì)酮等血液指標(biāo)作為此次建模的指標(biāo)體系,通過比較對(duì)照組與訓(xùn)練組的這些指標(biāo)的顯著性變化來驗(yàn)證大鼠力竭訓(xùn)練模型的建立是否成功,血液中各指標(biāo)見表2。

表2 本研究力竭訓(xùn)練建模后訓(xùn)練大鼠血漿中血紅蛋白、皮質(zhì)酮和睪酮的含量變化一覽表Table 2 Changes of Hb,Cortisol,Testosterone in Blood Plasma after Overtraining(M±SD)

同安靜組相比,訓(xùn)練E組建模后血漿血紅蛋白、皮質(zhì)酮和睪酮的含量均出現(xiàn)顯著性下降。

11周跑臺(tái)遞增負(fù)荷的訓(xùn)練過程中大鼠體重的變化:在訓(xùn)練的11周和訓(xùn)練后恢復(fù)的1周中,對(duì)對(duì)照組與單純訓(xùn)練組大鼠體重的變化進(jìn)行跟蹤測(cè)定(圖1)。

從圖1可看出,安靜訓(xùn)練組12周的建模過程中,大鼠體重均呈現(xiàn)規(guī)律的增長(zhǎng)趨勢(shì),前5周安靜對(duì)照組與單純訓(xùn)練組的大鼠體重基本無差異均呈現(xiàn)一定的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),但進(jìn)入第5周至第8周前,訓(xùn)練組因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)負(fù)荷的加大,大鼠體重顯著增長(zhǎng)程度降低,而且在進(jìn)入第8周至11周這個(gè)負(fù)荷明顯加大的力竭過度訓(xùn)練期,訓(xùn)練組大鼠的體重未增反降,在建模后1周的恢復(fù)期有所恢復(fù),但與同期安靜組對(duì)比,訓(xùn)練組大鼠的體重顯著性低于安靜對(duì)照組。

圖1 11周跑臺(tái)訓(xùn)練過程中與1周恢復(fù)后大鼠體重的變化情況示意圖Figure1. Weight of Rat during 11-weeks Exhaustive Training and after 1-weeks Recovery

2.2 過度訓(xùn)練后血液中各細(xì)胞因子指標(biāo)的變化

過度訓(xùn)練后36 h,取血液分離血漿Elisa試劑盒測(cè)得各細(xì)胞因子(表3)。同安靜對(duì)照組C組的單因素方差分析的結(jié)果表明(表3):過度訓(xùn)練E組,在末次訓(xùn)練結(jié)束后36 h血漿中IL-1b非常顯著性升高,IL-8、TNF-α達(dá)到顯著性升高,MCP-1與CINC則顯著性下降。DPI干預(yù)組同安靜對(duì)照組比較,IL-1b、MCP-1兩項(xiàng)指標(biāo)在過度訓(xùn)后顯著下降,IL-8、TNF-α兩項(xiàng)指標(biāo)則顯著性升高。CINC與MCP-1則有不同程度的下降,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 本研究過度運(yùn)動(dòng)后大鼠血漿中細(xì)胞因子的變化情況一覽表Table 3 Changes of Cytokine in Rat Plasma after Overtraining (M±SD,n=8)

2.3 過度運(yùn)動(dòng)后血液過氧化物水平的變化

2.3.1 過度運(yùn)動(dòng)后血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)指標(biāo)的測(cè)定

圖2表示,同安靜組對(duì)照組比較,單純運(yùn)動(dòng)組在過度訓(xùn)練后36 h大鼠血漿MDA水平急劇上升達(dá)到了極其顯著性水平,D組運(yùn)動(dòng)后36 h也有所升高達(dá)到顯著性水平。

2.3.2 過度運(yùn)動(dòng)后血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物髓過氧化物酶(MPO)指標(biāo)的測(cè)定

同安靜對(duì)照組比較,過度訓(xùn)練后36 h單純訓(xùn)練E組與D組的血漿髓過氧化物酶均升高,單因素方差分析的結(jié)果表明,E組的上升水平達(dá)到極其顯著性水平,D組達(dá)到顯著性水平(圖3)。

2.4 過度運(yùn)動(dòng)后中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶活性的測(cè)定

分離中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)胞中NADPH氧化酶采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定其OD值的結(jié)果表明(圖4),同安靜對(duì)照組比較,單純過度訓(xùn)練組的OD值明顯高于安靜對(duì)照組達(dá)到顯著性水平,而D組則略有提高但未達(dá)到顯著性水平。

圖2 各組大鼠在過度訓(xùn)練后36 h血漿MDA水平的變化示意圖Figure 2. Concerntration of MDA in Rat Blood Plasma after 36-hours of Overtra in ing

圖3 各組大鼠在過度訓(xùn)練后36 h血漿M PO水平的變化示意圖Figure 3. Concengtion of MPO in Rat Blood Plasma after 36-hours of Overtra in ing

圖4 各組大鼠在過度訓(xùn)練后36 h中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶活性的變化示意圖Figure 4. Activation of NADPH Oxidase in Rat Neutrophoile after 36-hours of Overtrain ing

2.5 過度運(yùn)動(dòng)后中性粒細(xì)胞凋亡的流式測(cè)定

圖5 過度訓(xùn)練后大鼠中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞凋亡的雙染色流式細(xì)胞測(cè)定示意圖Figure 5. Apoptosis and Necrosis of Neutrophil with the Methods of Annexin V/PIDouble Staining from Flow Cytometer

圖6 過度訓(xùn)練后各組大鼠中性粒細(xì)胞凋亡的百分比示意圖Figure 6. Percentage of Apoptosos Cell in Rat Neutrophoile after Overtrain ing

圖7 過度訓(xùn)練后各組大鼠中性粒細(xì)胞中壞死細(xì)胞的百分比示意圖Figure 7. Percent of Dead Cell in Rat Neutrophoils after Overtraining

圖6、圖7表示,通過分離血液中白細(xì)胞后進(jìn)行流式測(cè)定后發(fā)現(xiàn),過度訓(xùn)練后D組與E組大鼠中性粒細(xì)胞與凋亡率與死亡率均明顯高于安靜對(duì)照組,單因素方差分析表明,E組達(dá)到極其顯著性水平,而D組達(dá)到顯著性水平。

2.6 過度運(yùn)動(dòng)后對(duì)淋巴細(xì)胞DNA損傷的單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)

圖8為過度運(yùn)動(dòng)后36 h取血樣分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行的單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)是一種較為成熟的檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷的技術(shù)。當(dāng)DNA損傷時(shí)通過單細(xì)胞電泳可觀察到出現(xiàn)類似“彗星”尾巴的細(xì)胞出現(xiàn)。DNA在電泳中移動(dòng)的程度直接反映DNA分子的損傷程度,可用軟件測(cè)量彗星細(xì)胞的寬度和尾巴的長(zhǎng)度來分析損傷的程度。圖8是選擇最具有代表性DNA損傷程度的細(xì)胞熒光圖,其中,A圖顯示基本未有DNA損傷的細(xì)胞電泳的結(jié)果,B圖為輕度的淋巴細(xì)胞DNA損傷的電泳結(jié)果示圖,C圖為DNA損傷很嚴(yán)重的細(xì)胞。

圖8 淋巴細(xì)胞DNA損傷的最具有代表性的彗星細(xì)胞示意圖(200)Figure 8. DNA Damage of Lymph Cell from SCGE Experiment(200) (A is no injury l,B is a little DNA injured and C is critical DNA injured in cell)

每樣去100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)出現(xiàn)彗星細(xì)胞的百分比,并對(duì)彗星細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度進(jìn)行測(cè)量分析(表4):C組、D組與E組每100個(gè)細(xì)胞平均出現(xiàn)彗星細(xì)胞的百分率分別為8.33%、12.15%和21.52%。通過對(duì)其彗星細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度的測(cè)量并進(jìn)行單因素方差分析的結(jié)果表明,同安靜組比較,E組出現(xiàn)彗星的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于安靜組并達(dá)到極其顯著性水平,且無論是彗星細(xì)胞的寬度和尾長(zhǎng)均明顯大于安靜組,均達(dá)到顯著性水平,而D組同安靜組相比雖大于安靜組但均未達(dá)到顯著性水平。

2.7 過度運(yùn)動(dòng)后對(duì)中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基的gp91phox與p47phox的共定位的免疫化學(xué)的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)

為了從分子水平上取得過度運(yùn)動(dòng)對(duì)中性粒細(xì)胞NADPH氧化的激活的證明,采用激光共聚焦與細(xì)胞免疫化學(xué)相結(jié)合的技術(shù),對(duì)過度運(yùn)動(dòng)后大鼠的中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基gp91phox與p47phox進(jìn)行了共定位,觀察了NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基p47phox在激活時(shí)由胞質(zhì)移位到胞膜與胞膜關(guān)鍵亞基gp91phox的共融合定位。

圖9是對(duì)照安靜組中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵亞基的p47phox和gp91phox以及核染色的圖片,其中,藍(lán)色為核染色,綠色為p47phox染色,紅色為gp91phox染色,把這3個(gè)圖片融合到一起發(fā)現(xiàn)在胞膜上未出現(xiàn)黃色的染色,說明p47phox未移位到胞膜上(圖9)。而圖10的過度訓(xùn)練后提取的中性粒細(xì)胞的染色定位圖示融合的圖片的胞膜上出現(xiàn)了黃色的融合染色,說明p47phox已移位到胞膜與gp91phox結(jié)合(圖10)。

3 討論

3.1 過度訓(xùn)練模型的成功建立

該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是建立一個(gè)成功的過度訓(xùn)練模型,此次模型是通過參考Hohl R過度訓(xùn)練模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定的修改,通過檢測(cè)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力、體力精神狀態(tài)、監(jiān)控體重變化、測(cè)定血紅蛋白、皮質(zhì)酮及睪酮的變化來全面衡量大鼠的機(jī)體狀態(tài)等幾方面來成功建模的。該訓(xùn)練模型的特點(diǎn)是:1)建模時(shí)間長(zhǎng),從適應(yīng)到遞增負(fù)荷要?dú)v時(shí)12周,可達(dá)到運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠機(jī)體刺激更深刻;2)前期的適應(yīng)性訓(xùn)練歷時(shí)4周,可使不同體質(zhì)狀態(tài)的大鼠都能達(dá)到一個(gè)良好的適應(yīng)狀態(tài);3)遞增負(fù)荷以不增加跑臺(tái)的速度而增加訓(xùn)練的頻次來實(shí)現(xiàn),此法一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是可使大鼠損傷小而恢復(fù)快,這次建模因意外死亡的大鼠只有2只,另外,多次刺激可使運(yùn)動(dòng)負(fù)荷加大,對(duì)大鼠產(chǎn)生的刺激更深入。

表4 本研究單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA損傷結(jié)果一覽表Table 4 Results for DNA Injury of Lymphocyte Detected by SCGE

圖9 對(duì)照組C大鼠中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶gp91phox與p47phox的共定位(×200)Figure 9. Co-localization between the gp91phox and p47phox of the NADPH-oxidase Subun ite in Control Group C Using Immunocytochem istry and Confocal M icroscopy(×200)

圖10 訓(xùn)練E組大鼠中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶gp91phox與p47phox的共定位(×200)Figure10. Co-localization between the gp91phox and p47phox of the NADPH-oxidase Subunite in Group E Using Immunocytochem istry and Confocal M icroscopy(×200)

3.2 過度運(yùn)動(dòng)對(duì)吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌激活有關(guān)的細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)的影響

在機(jī)體的免疫活動(dòng)中,免疫細(xì)胞受機(jī)體多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié),其中,IL-1β是一種強(qiáng)烈的炎癥細(xì)胞因子,除可調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能外,還作用于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。

TNF-α則由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬,抗感染,引起發(fā)熱,誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成,促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化,促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化,是重要的炎癥介質(zhì),并參與某些自身免疫病的病理損傷[11]。

IL-8是在腫瘤壞死因子等的刺激下,由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生兩種反應(yīng):一是,促進(jìn)細(xì)胞溶酶體的釋放和呼吸爆發(fā),形成超氧化物和過氧化氫;二是,有利于對(duì)病原微生物的吞噬。同時(shí),IL-8為中性粒細(xì)胞游走因子,能刺激蛋白酶釋放。有研究證明,大鼠的中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化性細(xì)胞因子(CINC)相當(dāng)于IL-8[21]。

MCP-1具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化和激活單核細(xì)胞的雙重功能,MCP-1作為主要的單核細(xì)胞趨化因子,不但對(duì)單核巨噬細(xì)胞具有雙重作用,而且,對(duì)T淋巴細(xì)胞也具有類似的作用,MCP-1是由多種細(xì)胞產(chǎn)生,包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞免等生成的趨化因子,其中,IL-1、TNF-α、IL-4能促進(jìn)它的表達(dá),缺乏MCP-1的小鼠T細(xì)胞應(yīng)答明顯降低,特別是Th2細(xì)胞應(yīng)答,表明MCP-1在T細(xì)胞分化中具有重要作用,可影響T細(xì)胞在多階段的分化過程[18]。

上述所選測(cè)的這些免疫調(diào)節(jié)因子,無一不是對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用。通過同安靜對(duì)照組的比較發(fā)現(xiàn),過度訓(xùn)練引起這些免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)不同程度的增加,因此,可提示過度運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的活化促進(jìn)中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞的吞噬作用,是中性粒細(xì)胞向組織細(xì)胞侵潤(rùn)增加并誘發(fā)組織細(xì)胞炎癥的發(fā)生。同時(shí),這些免疫調(diào)節(jié)因子可增加Th2細(xì)胞應(yīng)答,誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化時(shí)由Th1向Th2細(xì)胞的漂移,運(yùn)動(dòng)后機(jī)體免疫力的下降和感染率的上升主要和Th1型反應(yīng)受抑有關(guān),體液免疫功能變化不大。這和之前Gomez M D(2009年)[7]報(bào)道的運(yùn)動(dòng)引起的免疫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致細(xì)胞免疫減弱的結(jié)果相吻合。

3.3 過度運(yùn)動(dòng)對(duì)NADPH氧化酶與MPO激活及活性氧的產(chǎn)生所致的外周血過氧化水平的變化

NADPH氧化酶是調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生的特殊功能酶,活化后的NADPH氧化酶以NADPH為遞氫體,催化反應(yīng):NADPH+2O2→NADP++H++2O-2,O-2在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下生成H2O2[4]。在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中存在著髓過氧化物酶(MPO),在有氯化物存在的條件下,該酶可將H2O2還原生成次氯酸HOCL·,HOCL·是強(qiáng)氧化劑和殺菌因子。測(cè)定中性粒細(xì)胞所特有的酶——MPO被認(rèn)為是一個(gè)較好的反映中性粒細(xì)胞活性的指標(biāo)[23]。中性粒細(xì)胞被激活后,可以脫顆粒而將MPO釋放到細(xì)胞外,MPO具有強(qiáng)力的感染后特征可引起其他細(xì)胞組織的損傷。

測(cè)定過度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后中性粒NADPH氧化酶的活性、血漿MPO的表達(dá)及血漿反映脂質(zhì)過氧化水平MDA的濃度,并與安靜對(duì)照組和DPI干預(yù)組對(duì)比發(fā)現(xiàn),過度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶活性顯著增加,血漿MPO的濃度增加,血漿MDA濃度顯著增加,說明過度運(yùn)動(dòng)可使中性粒細(xì)胞激活通過NADPH氧化酶的激活來釋放大量的活性氧和MPO,以此誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)和吞噬的免疫反應(yīng),而引起血液的脂質(zhì)的過氧化水平增加。

3.4 過度運(yùn)動(dòng)使中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶激活的共聚焦的蛋白共定位的直接證據(jù)

圖11顯示,NADPH氧化酶未激活時(shí)其亞基p47phox、p40phox、p67phox位于胞質(zhì)中,而當(dāng)其激活時(shí)則移位到胞膜上與胞膜上的亞基結(jié)合,這是NADPH氧化酶激活的直接證據(jù)。

圖11 NADPH氧化酶在激活與非激活狀態(tài)時(shí)各亞基的定位示意圖[22]Figure 11. Location of Subun ite of NADPH Oxidase druing Inactive and Active

因此,本研究采用“免疫細(xì)胞化學(xué)和激光共聚焦顯微掃描(Immunostaining and confocal laser-scanning microscopy)”技術(shù),這是目前國(guó)際上研究蛋白遷移和定位的最先進(jìn)的技術(shù)之一[5]。根據(jù)研究的結(jié)果顯示,過度運(yùn)動(dòng)后中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基p47phox移位至胞膜與gp91phox結(jié)合,而DPI組由于實(shí)施了對(duì)訓(xùn)練大鼠進(jìn)行NADPH氧化酶的抑制劑的干預(yù),則未明顯的出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶的蛋白移位的結(jié)果。此實(shí)驗(yàn)有力證明了過度運(yùn)動(dòng)可激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶,由此引發(fā)中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā),從而釋放大量的活性氧進(jìn)入血液,這與本研究測(cè)定的血漿MDA水平的升高相吻合。

3.5 過度運(yùn)動(dòng)對(duì)中性粒細(xì)胞Annexin V/PI雙染色法的流式細(xì)胞術(shù)

Annexin V/PI雙染色法的流式細(xì)胞術(shù)是適合于懸浮細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)靈敏度很高的方法,本研究利用FITC與PI雙染色對(duì)死亡細(xì)胞液有一個(gè)很好的檢測(cè),因?yàn)橥淌杉?xì)胞在呼吸爆發(fā)后釋放大量的活性氧及溶酶體后即死亡,而本研究結(jié)合運(yùn)動(dòng)的連續(xù)性和應(yīng)激性的特點(diǎn),使得在過度運(yùn)動(dòng)后36 h取樣合并此種方法的利用避免了機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激刺激和對(duì)死亡細(xì)胞的檢測(cè)來反映過度運(yùn)動(dòng)對(duì)中性粒細(xì)胞的凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果表明,過度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,而DPI組中性粒細(xì)胞的凋亡數(shù)和死亡細(xì)胞數(shù)較過度運(yùn)動(dòng)組有所減少。說明過度運(yùn)動(dòng)引起的中性粒細(xì)胞的激活使其NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的活性氧,可能是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要來源,但不排除運(yùn)動(dòng)引起的其他途徑活性氧的產(chǎn)生。而合并檢測(cè)的過度運(yùn)動(dòng)后大鼠血液中MDA的濃度的升高實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此途徑產(chǎn)生的過多的ROS可能是使血液中過氧化水平的提高的主要原因。

3.6 過度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞DNA損傷的彗星實(shí)驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)是一種較為成熟的檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷的技術(shù)。細(xì)胞DNA在電泳中移動(dòng)的程度直接反映DNA分子的損傷程度。這種技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物監(jiān)測(cè)、遺傳毒理學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域[13]。彗星試驗(yàn)方法原理的核心是檢測(cè)有核細(xì)胞的DNA損傷情況。粒細(xì)胞主要在組織中發(fā)揮作用,在血流中停留較短時(shí)間后衰老死亡。而淋巴細(xì)胞往返于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi),可增殖、分化,壽命數(shù)月,有的長(zhǎng)達(dá)1年以上。因此,利用這種方法測(cè)定了過度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞DNA損傷情況。實(shí)驗(yàn)表明,過度訓(xùn)練后,單純訓(xùn)練組淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加,根據(jù)凋亡嚴(yán)重程度的測(cè)量凋亡細(xì)胞的尾長(zhǎng)和尾寬的結(jié)果也顯示,單純訓(xùn)練組大鼠的淋巴細(xì)胞DNA損傷的程度要明顯高于安靜組, DPI組大鼠的淋巴細(xì)胞的DNA損傷程度數(shù)和程度也高于安靜組。

3.7 過度運(yùn)動(dòng)引起的中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)釋放的活性氧對(duì)淋巴細(xì)胞DNA損傷的可能機(jī)制

本次實(shí)驗(yàn)通過單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)過度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞DNA損傷的檢測(cè)以及應(yīng)用NADPH氧化酶抑制劑DPI作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DPI組大鼠的淋巴細(xì)胞DNA損傷程度低于過度訓(xùn)練組,說明過度運(yùn)動(dòng)引起的中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的可能機(jī)制。因?yàn)?過度運(yùn)動(dòng)引起的中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧釋放入血,不但可導(dǎo)致血液的脂質(zhì)過氧化,還會(huì)引起血液中其他細(xì)胞的一系列過氧化反應(yīng)。有研究證明,自由基對(duì)DNA具有損傷作用[6],自由基可引起細(xì)胞內(nèi)DNA的氫鏈斷裂、堿基降解和主鏈解旋,所有核酸成分均可受到自由基的攻擊,這種損傷可被一些特殊機(jī)制修復(fù),但也可造成永久性損傷。所以,當(dāng)細(xì)胞DNA受損傷時(shí),可造成細(xì)胞生物學(xué)活性改變,甚至導(dǎo)致基因突變、腫瘤與細(xì)胞死亡。但由于DPI干預(yù)組的DNA損傷也高于安靜對(duì)照組,說明中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶途徑不是血液中ROS產(chǎn)生的惟一途徑,而通過文獻(xiàn)查詢可知,其他途徑產(chǎn)生的過氧化物及過度運(yùn)動(dòng)引起的血液中炎性因子和趨化因子增多又可作為激活NADPH氧化酶的新途徑[1,16]。因此,1)過度運(yùn)動(dòng)時(shí)其他途徑的活性氧對(duì)DNA的損傷;2)過度運(yùn)動(dòng)時(shí)炎性因子對(duì)DNA的直接損傷;3)過度運(yùn)動(dòng)激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS,同時(shí),1)、2)途徑的產(chǎn)物過氧化氫和細(xì)胞因子又可激活NADPH酶產(chǎn)生更多的ROS。因此,這3個(gè)途徑的聯(lián)合作用是過度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致免疫細(xì)胞DNA損傷的可能機(jī)理(圖12)。

圖12 過度運(yùn)動(dòng)引起的ROS的產(chǎn)生途徑及對(duì)淋巴細(xì)胞的過氧化損傷示意圖Figure 12. Pathway of ROS and the Peroxidation Injury of Lymph Cell Induced by Overtrain ing

3.8 過度運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞免疫減弱的原因透析

圖13 NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS對(duì)運(yùn)動(dòng)性免疫抑制影響的理論機(jī)制示意圖Figure 13. The Effect of Ras on Exercise-Induced Imm unosuppression Caused by NADPH Oxidase

如圖13所示,過度運(yùn)動(dòng)時(shí)吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)將引起細(xì)胞的氧化脅迫,NADPH氧化酶過度激活,同時(shí),細(xì)胞其他途徑產(chǎn)生的H2O2增加對(duì)NADPH氧化酶的正反饋刺激;加之過氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放等3個(gè)方面使細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生急劇上升,打破了ROS的平衡狀態(tài)[15,20]。一方面,過量的ROS通過間接損傷DNA、類脂和蛋白或是直接通過ROS介導(dǎo)激活信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10];或使單核巨嗜細(xì)胞內(nèi)的AMPK失活,從而中斷了蛋白酪氨酸磷酸化而使細(xì)胞死亡而導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的非特異性細(xì)胞免疫功能減弱[3];另一方面,吞噬細(xì)胞通過參與、分泌趨化因調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化而減弱了T細(xì)胞的功能,加之過量活性氧的產(chǎn)生本身對(duì)淋巴細(xì)胞DNA的損傷造成細(xì)胞生物學(xué)活性改變,甚至導(dǎo)致基因突變、腫瘤以及淋巴細(xì)胞的死亡而導(dǎo)致機(jī)體的特異性免疫功能減弱,表現(xiàn)為以吞噬細(xì)胞為主體的非特異性細(xì)胞免疫和T細(xì)胞為主體的特異性細(xì)胞免疫降低。

4 結(jié)論

1.過度運(yùn)動(dòng)可激活外周血中性粒細(xì)胞的NADPH氧化酶產(chǎn)生氧化呼吸爆發(fā),而產(chǎn)生過多的ROS使血液的脂質(zhì)過氧化水平提高。

2.過度運(yùn)動(dòng)可引起外周血炎性因子和趨化分子分泌的增加,從而有可能誘發(fā)組織炎癥的發(fā)生和T淋巴細(xì)胞的分化而影響Th1/Th2平衡的免疫調(diào)節(jié),導(dǎo)致細(xì)胞免疫的減弱。

3.過度運(yùn)動(dòng)激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶途徑產(chǎn)生的ROS可引起中性粒細(xì)胞本身的凋亡甚至死亡,并引起淋巴細(xì)胞的DNA損傷。

3.過度運(yùn)動(dòng)激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶產(chǎn)生過多的ROS可引起外周血脂質(zhì)過氧化水平的上調(diào),而吞噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的損傷、炎性因子的大量分泌及免疫調(diào)節(jié)因子等眾多因素,是運(yùn)動(dòng)型免疫抑制的可能因素。

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Research on DNA Damage of Lymphocytes Induced by ROSMediated by NADPH-Oxidase in Neutrophils and Intervention after Overtrain ing

CHEN Pei-jie1,DONG Jing-mei1,2

Objective:To investigate the effects of reactive oxygen species(ROS)mediated by NADPH-oxidase in neutrophils and intervention of biphenyl iodide(DPI)on DNA damage of lymp hocytes induced by over training.M ethods:30 male vistar rats were random ly divided into three groups:blank control group(C,n=10),overtraining group(E,n=10)and DPI intervention group(G,n=10).Group E and G were training in standard treadmill w ith an increasing load fo r 11 weeks,w ithin 36h-40h after the last training,eight rats w ere random ly pick out f rom each group and the orbital venous blood w ere obtained.EL ISA was used to detect the level of cytokine and blood lipid peroxidation in blood p lasma.U tilizing flow cytometer and AnnexinV/PI double staining to measure the apoptosis and necrosis of neutrophil,using immunocytochemistry and confocal microscopy to indentify the co-localization bo th gp91phox and p47phox,w hich is the key subunits of the NADPH-oxidase and single cell gel electrophoresis(SCGE)was used to detect DNA damage of lymphocytes.Results:1.Compared with group C,the concentration of IL-1b,IL-8,TNF-αwere significantly increased and the MCP-1,CINC w ere significantly decreased in rat blood plasma of group E(respectively,P<0.01 andP<0.05);the concentration of IL-1b,MCP-1 w ere decreased significantly(P<0.05), and IL-8,TNF-αwere significantly increased(P<0.05)in rat blood plasma of group D;the level of MDA,M PO were increased in p lasma of group E and D(respectivelyP<0.01 andP<0.05).2.Compared with group C,the percentage of apop tosis of neutrophils significantly increased(P<0.01)in group E and D,and the percentage of cell death increased in groups E (P<0.05)w hile no significant change in group D.3.Compared w ith group C,the number of comet cells,w hich indicate the DNA damage significantly increased(P<0.01)and the w idth and the tail length of comet cells w ere significant increased in group E w hile no increase in group D.4.the co-location confocal of gp91phox and p47phoxhe,a key subunit of NADPH oxidase was localized disp lay in group E w hile no location in group C.Conclusion:1.Excessive exercise can lead to the upgrade of inflammatory cytokines and chemokines in peripheral blood, w hich may induce tissue inflammation and regulate the differentiation of T lymphocytes.2.O-vertraining can activate NADPH oxidase of peripheral blood neutrophils w hich can mediate to p roduce too much ROS and lead to the lipid peroxidation in blood.3.The p roduction of ROS from these pathway and upgrade of the levels of peroxide can cause apoptosis o r death of neutrophils and DNA damage of lymph cell.4 Too much ROS generated by this pathway in the phagocytic cells,the upgrade of inflammatory cytokines,imm une regulato ry facto rs and the peroxidation injury of lymph cell that all induced by overtraining can regulate cellular immune function,w hich may be the facto rs caused by exercise-induced immunosupp ression.

overtraining;neutrophils;radical oxygen species(ROS);lym phocy te;DNA injury;intervention;rat;animal experiment

G804.5

A

2010-08-30;

2010-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30971422);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(S30802)。

陳佩杰(1962-),男,浙江舟山人,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與免疫,Tel:(021)51253626,E-mail:chengpjk@online.sh.cn;董靜梅(1969-),女,甘肅慶陽人,副教授,在讀博士研究生,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與免疫,Tel:(021)35080378,E-mail:lzdjm119@sohu.com。

1.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院,上海200438;2.蘭州城市學(xué)院體育學(xué)院,甘肅蘭州730070

1.School of Kinesiology,Shanghai University of Spo rt, Shanghai 200438,China;2.School of Physical Education,Lanzhou City University,Lanzhou 730070,China.

1000-677X(2011)01-0029-10