摘要 目的：探討轉(zhuǎn)錄因子Fra-1在人乳腺良、惡性腫瘤組織中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)的定位。方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)良、惡性乳腺腫瘤組織Fra-1表達(dá)及細(xì)胞定位；并分析惡性乳腺腫瘤組織Fra-1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后指標(biāo)ER、PR和HER-2表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：61例良、惡性腫瘤組織都存在Fra-1的細(xì)胞核表達(dá)。在20例良性腫瘤組織中，17例(85.0％)Fra-1主要定位于上皮細(xì)胞核內(nèi)，3例(15.0％)可見Fra-1細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)共表達(dá)。而37例(90.2％)惡性腫瘤組織存在Fra-1細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)共表達(dá)，F(xiàn)ra-1在惡性腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于良性腫瘤(P=0.000)。惡性腫瘤Fra-1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與ER、PR和HER--2的表達(dá)無明顯相關(guān)性。結(jié)論：Fra-1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度和方式與乳腺癌上皮細(xì)胞的癌變有關(guān)；它在乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的滯留與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 乳腺癌 Fra-1 轉(zhuǎn)錄因子 免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)：R739.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006－1533(2011)01－0044－04

目前已發(fā)現(xiàn)許多原癌基因編碼的產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄因子，它通過改變細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育程序在細(xì)胞的癌變過程中發(fā)揮重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白－1(AP-1)是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中轉(zhuǎn)站，在接受外源刺激、調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要的作用。AP-1家族中的Jun-Jun同源二聚體或Fos-Jun異源二聚體能與靶基因啟動(dòng)子上的TPA反應(yīng)元件TRE結(jié)合，而TPA為一強(qiáng)致癌物，因此，AP-1復(fù)合物一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就預(yù)示它與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在關(guān)系。

Fra-1為Fos家族中的一員，由于Fra-1沒有轉(zhuǎn)錄激

通訊作者：宋玉華。E-mail：qdsongyh＠163.com活區(qū)，早期的研究推測(cè)Fra-1可能參與AP-1的負(fù)向調(diào)控。然而，最近的證據(jù)表明，F(xiàn)ra-1在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲以及維持轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性表型方面具有重要的作用。研究顯示，在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)Fra-1導(dǎo)致細(xì)胞貼壁非依賴性生長以及在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。在多種腫瘤及腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Fra-1的高表達(dá)，提示Fra-1參與了腫瘤的惡性進(jìn)展。本研究探討Fra-1在中國人乳腺腫瘤組織中的表達(dá)，并對(duì)它與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 對(duì)象和方法

1.1樣品收集

61例良、惡性乳腺組織標(biāo)本石蠟切片收集自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬第307醫(yī)院。組織標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2臨床及病理資料

61例臨床病例均為女性患者，年齡為31～72歲，中位年齡47歲。61例臨床標(biāo)本中，良性20例(其中，乳腺纖維腺瘤10例，乳腺小葉增生伴腺病10例)；惡性41例(其中，浸潤性導(dǎo)管癌31例，浸潤性小葉癌4例，浸潤性導(dǎo)管小葉癌6例)。乳腺癌標(biāo)本中，Ⅰ期6例，Ⅱ期24例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。乳腺癌標(biāo)本中雌激素受體陰性(ER-)22例，雌激素受體陽性(ER+)19例；孕激素受體陰性(PR-)24例，孕激素受體陽性(PR+)17例；表皮生長因子受體低表達(dá)(HER2-或HER2+)25例，表皮生長因子受體過表達(dá)(HER2++或HER2+++)16例。

1.3免疫組織化學(xué)分析

Fra-1兔多克隆抗體購自美國Abeam公司。采用sP三步法免疫組織化學(xué)染色，SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒為ZYMED公司產(chǎn)品，按sP試劑盒說明書操作。EDTA緩沖液熱抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精襯染，以PBS及非特異性人免疫球蛋白Ig代替Fra-1作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定

根據(jù)細(xì)胞核染色結(jié)果將核陽性分為高表達(dá)(≥75％細(xì)胞陽性)和低表達(dá)(<75％細(xì)胞陽性)；根據(jù)細(xì)胞質(zhì)的染色結(jié)果將細(xì)胞質(zhì)陽性分為高表達(dá)(強(qiáng)染色)和低表達(dá)(弱染色)；陰性為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)不染色。通過光學(xué)顯微鏡400倍放大對(duì)組織切片細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Fisher’s精確檢驗(yàn)比較各參數(shù)間的差異，P<0.05為有顯著性差異，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Fra-1在良、惡性乳腺腫瘤組織中的表達(dá)

在所有乳腺腫瘤組織標(biāo)本中，均存在Fra-1在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。分別以PBS及非特異性人Ig取代抗Fra-1抗體作為陰性對(duì)照，未檢測(cè)到良、惡性腫瘤組織細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)，表明該抗體的特異性。Fra-I在良、惡性乳腺腫瘤組織中的表達(dá)見表1。

2.2 Fra-1在良性乳腺腫瘤組織中的表達(dá)

在85％(17／20)的良性腫瘤組織中，F(xiàn)ra-1主要定位于上皮細(xì)胞核內(nèi)，炎性細(xì)胞為陰性，但并非所有的上皮細(xì)胞均存在Fra-1核染色。乳腺纖維腺瘤的染色結(jié)果顯示，在導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，F(xiàn)ra-1染色大多出現(xiàn)于腔面上皮層的頂端，腺泡基底膜鄰近的肌上皮層為陰性。小葉基底細(xì)胞可見弱的細(xì)胞核染色。多數(shù)病例(17／20，85％)中，F(xiàn)ra-1僅表達(dá)于細(xì)胞核，3例(3／20，15％)標(biāo)本可見細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)Fra-1染色均為陽性。

2.3Fra-1在惡性乳腺組織中的表達(dá)

與乳腺纖維腺瘤和乳腺小葉增生伴腺病相比，所有不同組織類型的乳腺癌標(biāo)本均存在Fra-1核染色強(qiáng)陽性(100％細(xì)胞核或≥75％細(xì)胞核染色陽性)。在約90％的乳腺癌標(biāo)本中可見到不同程度的細(xì)胞質(zhì)染色，盡管細(xì)胞質(zhì)的染色強(qiáng)度弱于細(xì)胞核。在腫瘤細(xì)胞附近的周圍正常組織很少見到Fra-1在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，在正常的上皮組織僅可見基底細(xì)胞層存在Fra-1的細(xì)胞核表達(dá)。在56％(23／41)的乳腺癌組織觀察到Fra-1的細(xì)胞質(zhì)弱表達(dá)，34％(14／41)存在強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核共同染色。

2.4同一腫瘤組織中Era-1的表達(dá)

對(duì)同一張組織切片不同視野乳腺腫瘤組織Fra-l表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)癌旁正常組織中，F(xiàn)ra-1表達(dá)呈弱陽性，其表達(dá)僅定位于細(xì)胞核內(nèi)，在分化差的腫瘤組織中，Era-1同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而且Fra-1表達(dá)可見于所有的癌細(xì)胞。

2.5良、惡性乳腺腫瘤組織Fra-1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的差別

良性乳腺組織20例，其中3例存在細(xì)胞質(zhì)的弱表達(dá)，陽性率為15％。惡性乳腺組織41例，其中23例細(xì)胞質(zhì)弱表達(dá)，14例細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)，僅有4例細(xì)胞質(zhì)為陰性，陽性率為90.2％。良、惡性組織細(xì)胞質(zhì)表達(dá)率存在顯著性差異(P=0.000)，見表2。

2.6惡性乳腺腫瘤組織Fra-1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與EK、PR及HER2的關(guān)系

乳腺癌組織中，ER(-)22例，ER(+)19例；PR(-)24例，PR(+)17例；表皮生長因子受體HER2低表達(dá)23例，HER2過表達(dá)18例。未觀察到Fra-1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與ER、PR及HER2的相關(guān)性。結(jié)果見表3。

3 討論

在多種人類惡性腫瘤及腫瘤細(xì)胞系中可檢測(cè)到AP-l活性的升高，F(xiàn)ra-1在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及惡性腫瘤的發(fā)生過程中可能起到關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1與乳腺癌細(xì)胞系的高侵襲力有關(guān)，在過表達(dá)Fra-1的MCF-7細(xì)胞，F(xiàn)ra-1可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和細(xì)胞周期素Dl(cyctinDl)的表達(dá)，還有研究表明，F(xiàn)ra-1可誘導(dǎo)骨橋蛋白、血小板反應(yīng)素和CD44的表達(dá)，提示Fra-1可能影響細(xì)胞的增生、侵襲和血管生成。有人應(yīng)用基因芯片技術(shù)，研究了Fra-1對(duì)4種高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系和9種低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系的運(yùn)動(dòng)和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24種表達(dá)不同的基因中，F(xiàn)ra-1在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。同樣，用基因芯片技術(shù)檢測(cè)22種人類乳腺癌上皮細(xì)胞株／系及來源于原發(fā)性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、乳房減少成形術(shù)的細(xì)胞，獲得相似的結(jié)果。因此有關(guān)研究人員認(rèn)為，F(xiàn)ra-1可能是乳腺癌的一個(gè)有價(jià)值的診斷標(biāo)志。

Philips等應(yīng)用Northern blot檢測(cè)不同乳腺癌細(xì)胞系Fra-1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ER(-)乳腺癌細(xì)胞Fra-1表達(dá)明顯高于ER(+)細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)Fos家族其它成員和Jun蛋白在不同ER狀態(tài)細(xì)胞間表達(dá)的差別。ER㈠腫瘤細(xì)胞生長速度快，在裸鼠中易形成轉(zhuǎn)移瘤。Bamberger等用Western blot檢測(cè)了乳腺癌組織AP-1家族成員各蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FosB與ER(+)、分化好的腫瘤表型相關(guān)，F(xiàn)ra-1表達(dá)與乳腺癌的臨床分期、組織類型和HER2表達(dá)狀態(tài)無關(guān)，但與組織分級(jí)(高分級(jí)，G3)有關(guān)，與ER狀態(tài)負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Fra-1在人乳腺癌組織中表達(dá)的意義，筆者用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了Fra-1在良、惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)，分析了Fra-1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后指標(biāo)ER、PR和HER2的關(guān)系。結(jié)果顯示，所有瘤組織(包括良、惡性腫瘤)都存在Fra-1細(xì)胞核表達(dá)，而腫瘤周圍的正常組織中，僅有上皮細(xì)胞存在弱的Fra-1細(xì)胞核表達(dá)。在良性腫瘤中，Era-1表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，20例纖維腺瘤和小葉增生伴腺病患者中只有3例呈現(xiàn)細(xì)胞核表達(dá)伴細(xì)胞質(zhì)弱表達(dá)。但在不同組織類型的乳腺癌中可見Era-1細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的共表達(dá)，約90％的癌組織Fra-1表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)共表達(dá)。然而，受免疫組化學(xué)方法靈敏度限制，尚不能檢測(cè)出Fra-1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)輕度增加。雖然Era-1表達(dá)不能成為乳腺癌有價(jià)值的診斷指標(biāo)，但Fra-1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度及方式與上皮細(xì)胞的癌變有關(guān)。

已有報(bào)道，在乳腺癌細(xì)胞中Fra-1表達(dá)與ER表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性，也有人發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織Fra-1表達(dá)與ER狀態(tài)相關(guān)。但是ER(-)細(xì)胞中，F(xiàn)ra-1高表達(dá)與磷酸化可能僅發(fā)生于培養(yǎng)條件下，因?yàn)闊o論在ER(－)和ER(+)的臨床惡性腫瘤組織樣本中，通過Western blot均未檢測(cè)到磷酸化Fra-1蛋白的表達(dá)。另有研究顯示，F(xiàn)ra-1表達(dá)與PR的異構(gòu)體PR-B有負(fù)相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)Fra-1表達(dá)與ER、PR及HER2的相關(guān)性，因此目前尚很難判斷Fra-1是否能成為一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。

Fra-1缺乏轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，推測(cè)Fra-1與c-Jun形成二聚體調(diào)控基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，Era-1過表達(dá)啟動(dòng)了腫瘤惡性進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)。EMT存在腫瘤的進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞EMT可使之獲得較強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1在肺上皮細(xì)胞的異常分化及轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮一定的作用。但是，F(xiàn)ra-1在腫瘤發(fā)生中的確切作用仍不明確。許多轉(zhuǎn)錄因子穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，F(xiàn)ra-1的合成始于細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)入核內(nèi)與靶基因的DNA序列結(jié)合。當(dāng)Fra-1過度表達(dá)時(shí)，可能存在Era-1的核輸入受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Fra-1蛋白水平增高。Era-1在細(xì)胞質(zhì)的滯留可能在乳腺癌的發(fā)生過程中起一定的作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，核蛋白p21Cipl／WAF1可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)發(fā)生p21Cipl／WAFl轉(zhuǎn)移時(shí)，各種凋亡信號(hào)不再能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于乳腺癌細(xì)胞中Era-1細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)的非轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。