摘要：為建立適于優(yōu)良品種遺傳轉(zhuǎn)化的高效組織培養(yǎng)體系，本研究以3種山東省推廣小麥品種(濟(jì)麥19、良星99、魯麥14)和模式品種Bobwhite為材料，以成熟胚為外植體對其愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，探討了2，4-D不同濃度下的3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ms、N₆、MSB₅)和4種激素配比的分化培養(yǎng)基對小麥成熟胚離體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，N₆培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好，平均誘導(dǎo)率超過了80％，且當(dāng)2，4-D的濃度為4mg／L時誘導(dǎo)效果最佳。4種激素配比均可誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織分化，但分化率較低且處理之間差別較大，添加0.5mg/LIAA和2mg／L ZT的Ms培養(yǎng)基的平均分化率最高，為22.58％。小麥基因型的差別主要影響其分化率的高低而對誘導(dǎo)率的影響不大，3個品種中用于轉(zhuǎn)化的最佳品種為魯麥14。

關(guān)鍵詞：小麥成熟胚；愈傷組織；誘導(dǎo)；分化

中圖分類號：S512.1⁺10.353

文獻(xiàn)標(biāo)識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—O001—05

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪饕募Z食作物之一，在谷物栽培中居首位，其中普通小麥種植最廣，約占全世界小麥總面積的90％。隨著對小麥抗性、品質(zhì)研究的深入以及常規(guī)育種的限制，應(yīng)用生物技術(shù)對小麥進(jìn)行品種改良越來越受人們重視，因此，必須建立起高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系為小麥遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

目前，以小麥幼胚、動穗、葉片、根、成熟胚等為外植體進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化，都成功獲得了再生植株。其中幼胚是轉(zhuǎn)化成功最多的外植體，許多研究認(rèn)為幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)率和植株再生率都較高，但幼胚易受季節(jié)、時間限制，短時間內(nèi)難以重復(fù)試驗，而小麥的成熟胚則能克服幼胚的不足，具有取材方便、周期短、不受季節(jié)和植株發(fā)育階段限制等優(yōu)點，因此用作轉(zhuǎn)化受體最為方便實用，但成熟胚再生率非常低。鑒于此，本試驗以山東省廣泛栽培的3個小麥品種為材料，對其成熟胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和分化的研究，旨在探索不同主推小麥品種成熟胚誘導(dǎo)和分化的有效體系以及優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因受體基因型，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

山東省3個小麥推廣品種濟(jì)麥19、良星99、魯麥14和模式品種Bobwhite的成熟種子，均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基有3種，分別添加2、4、6mg/L 2，4－D，構(gòu)成9種培養(yǎng)基：

①MS基本培養(yǎng)基+500mg/L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg／L)，分別稱為MS2、MS₄、MS₆培養(yǎng)基；

②N₆基本培養(yǎng)基+500mg／L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg/L)，分別稱為N6₆₂、N₆₄、N₆₆培養(yǎng)基；

④MSB₅基本培養(yǎng)基+500mg／L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg／L)，分別稱為MSB₅₂、MSB₅₄、MSB₅₆。

分化培養(yǎng)基：

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，因所加的激素配比不同構(gòu)成4種分化培養(yǎng)基，如下：

①MS基本培養(yǎng)基+0.5mg/LIAA+1mg/L ZT

②MS基本培養(yǎng)基+O，5 mg／L IAA+2 m∥L ZT

③MS基本培養(yǎng)基+1mg/LIAA+lmg/LzT

④MS基本培養(yǎng)基+1mg／LIAA+2mg/LzT

以上所有培養(yǎng)基均添加30g／L蔗糖和8g／L瓊脂粉，用NaOH調(diào)pH值到5.6—5.8，在121℃下經(jīng)1.1kg/cm²高壓濕熱滅菌20min。

1.3 方法

1.3.1 種子預(yù)處理

取顏色、大小一致的小麥種子各約500粒，用無菌ddH20沖洗一次，70％酒精處理1min，然后無菌水沖洗一次，再用無菌水浸泡，封口過夜浸泡18h，次日對種子進(jìn)行消毒處理，在超凈臺上用1‰的升汞消毒10min，無菌水漂洗3—4次。

1.3.2 成熟胚培養(yǎng)

剝?nèi)〕墒炫?，切碎，盾片向上置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(9cm培養(yǎng)皿平均每11／1.40—50個)，重復(fù)3次，在培養(yǎng)皿上標(biāo)明品種、培養(yǎng)基、日期和胚數(shù)，25℃暗培養(yǎng)兩周，統(tǒng)計出愈率。挑選生長良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000lx，每天光照16h，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，每兩周繼代培養(yǎng)一次，30d后統(tǒng)計愈傷組織分化率(隨時觀察，及時剔除褐化和污染愈傷)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

出愈率(％)=(出愈外植體數(shù)／接種外植體數(shù))×100，棄去污染和褐化的愈傷組織不計；分化率(％)=(分化出芽的愈傷數(shù)／接種愈傷數(shù))×100，棄去污染和褐化的愈傷組織不計；

采用DPS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基及2，4－D濃度對小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.1.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響小麥成熟胚在接種2—3d后即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，14d后統(tǒng)計各培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率(表1)，結(jié)果表明，小麥成熟胚在各個培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但誘導(dǎo)效率和愈傷質(zhì)量各不相同?？傮w來說，N₆培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率較高，其平均出愈率為81.40％；MS和MSB₅培養(yǎng)基的平均誘導(dǎo)率均低于80％，分別為72.40％和74.44％，但三者之間差異不顯著。MS培養(yǎng)基上除濟(jì)麥19的出愈率較低(42.22％)外，其它3個品種的出愈率均在80％以上；MSB₅培養(yǎng)基上除了良星99的出愈率較低(54.85％)外，其它3個品種的出愈率均在70％以上。從愈傷組織的質(zhì)量來看，N₆培養(yǎng)基的大多數(shù)愈傷組織結(jié)構(gòu)較致密，呈淡黃色，明顯好于MS和MSB₅培養(yǎng)基上的愈傷組織。因此，N₆培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷的效果較好。

2.2 不同激素配比對小麥成熟胚分化率的影響

2.1.2 2.4－D不同濃度對小麥成熟胚出愈率的影響不同濃度2，4－D對愈傷組織出愈率的影響因培養(yǎng)基和品種不同而異(表1)，隨著2，4－D濃度的升高，愈傷組織的出愈率變化沒有規(guī)律可循，因此，不同的品種在不同的培養(yǎng)基上適宜的2，4－D濃度不同，其中，MS在2mg/L 2，4-D濃度下誘導(dǎo)率最高，N₆和MSBs分別在4、6mg／L濃度下最高。從愈傷的質(zhì)量來看，大多數(shù)含4mg／L2，4-D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷質(zhì)量要好于含2mg/L和6mg／L 2，4-D的培養(yǎng)基。就本試驗的4個品種而言，N₆₄培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，均在90％左右。

誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，挑選生長良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到不同激素配比的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，除少數(shù)愈傷組織停止生長逐漸褐化外，大部分愈傷大約3—5d就開始分化，先長出綠點繼而分化出苗。30d后統(tǒng)計各培養(yǎng)基的分化率，其結(jié)果見表2。不同激素配比均可誘導(dǎo)小麥成熟胚愈傷組織的分化，但不同處理的分化率差別很大，最低的為4.76％，最高的為42.22％。就分化率的平均值而言，表現(xiàn)為隨著ZT濃度的升高，：分化率也有所提高，4個供試品種也大體表現(xiàn)出相同的趨勢。

2.3 不同基因型對小麥成熟胚離體培養(yǎng)的影響

從表3可知，不同基因型之間愈傷組織的出愈率差異不顯著；Bobwhite的分化率顯著高于濟(jì)麥19，但與其

它兩品種的差異不顯著。綜合愈傷質(zhì)量和平均出愈率來看，由高到低依次為魯麥14、Bobwhite、良星99、濟(jì)麥19，愈傷培養(yǎng)結(jié)果以MS2培養(yǎng)基為例見圖1。4個品種的分化率普遍偏低，其中Bobwhite最高(28.06％)，濟(jì)麥19最低(10.23％)。

3 討論與結(jié)論

小麥胚性愈傷組織出愈率和分化率的高低，除受小麥基因型影響外，還與培養(yǎng)基成分、外源激素的種類和濃度等因素有關(guān)。本研究所用的3種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的大部分元素都相同，只是有機(jī)成份和2，4－D濃度差別較大，誘導(dǎo)愈傷組織出愈率最高的是N₆₄培養(yǎng)基，平均誘導(dǎo)率超過了90％，且N₆₄培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，呈淡黃色，質(zhì)量也較好，因此從總體上來說N₆₄培養(yǎng)基對于這4種品種的出愈率而言是較好的。

在植物組織培養(yǎng)中，生長素和細(xì)胞分裂素的相對濃度控制著根和芽的分化，在小麥組織培養(yǎng)中多用較低濃度的IAA或NAA附加不同濃度KT或zT來誘導(dǎo)愈傷分化。與前人結(jié)果相比，本試驗中4種激素配比對供試品種成熟胚愈傷組織的分化率偏低，平均分化率最高僅為22.58％，為添加0.5mg／LIAA和2mg／LZT的培養(yǎng)基，其中Bobwhite的分化率最高，為42.22％。可能有兩方面的原因，一是由于所選小麥品種基因型的限制，二是因為成熟胚直接萌發(fā)出的芽較多(非胚性愈傷較多)。

小麥成熟胚的誘導(dǎo)和分化與其基因型有密切關(guān)系。從本試驗結(jié)果來看，各品種的出愈率相差不大，但分化率差異較大，因此基因型主要影響其分化率，這與邢莉萍等的研究結(jié)果一致。除Bobwhite外，其它3個基因型中，用于轉(zhuǎn)化的最佳品種是魯麥14，其次是良星99、濟(jì)麥19。

由前人的報道和本試驗結(jié)果來看，成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)并不困難，但其胚性愈傷組織較少，非胚性愈傷較多，而且誘導(dǎo)過程中胚容易直接萌發(fā)出芽，從而影響分化率，所以在試驗中應(yīng)及時切去萌發(fā)的小芽，否則會影響愈傷的繼續(xù)生長，劉香利等發(fā)現(xiàn)在接種時用鑷子夾傷胚芽可獲得較理想的效果。