摘要：從發(fā)酵床養(yǎng)殖墊料堆體中分離篩選到一株細(xì)菌，再次接種鋸末、稻殼與鴨糞的混合物，與空白對(duì)照組相比，堆積時(shí)間縮短3天，單位發(fā)酵墊料對(duì)糞污的處理能力增加，墊料在使用28—49天間，氨氣排放降低30％—50％。經(jīng)16SrDNA序列比較，該菌為枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵床；枯草芽孢桿菌；接種劑

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.11⁺8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001—4942(2010)11—0071—04

發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)起源于日本和巴西的自然養(yǎng)豬法，主要是將鋸末、稻殼等材料接種生物菌種后堆積發(fā)酵后用做墊料，使糞污分解產(chǎn)生的臭味物質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體固定下來(lái)，達(dá)到降低養(yǎng)殖舍內(nèi)有害氣體濃度、減少養(yǎng)殖污染排放的目的。

選擇合適的菌種是發(fā)酵床是否能夠成功應(yīng)用的基礎(chǔ)與前提，只有使發(fā)酵床墊料中具有生理特性的菌種達(dá)到一定數(shù)量，才能保證發(fā)酵墊料的使用效果。糞便與發(fā)酵床的周邊環(huán)境中同樣存在多種微生物，必須向發(fā)酵床中接種合適的菌種才能達(dá)到減少污染排放的目的。其中，最值得關(guān)注的是兩個(gè)方面：第一，接種的微生物必須具備旺盛的蛋白質(zhì)代謝能力。謝金防等(2008)指出動(dòng)物糞便中各種營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，放置在自然環(huán)境中時(shí)，會(huì)因微生物快速生長(zhǎng)代謝而放出大量惡臭氣體，因此提出需要篩選的菌株必須具備較高的蛋白酶產(chǎn)生活力，以促進(jìn)有機(jī)物降解，加速糞污腐熟進(jìn)程，同時(shí)還有利于消除致臭物質(zhì)，減輕對(duì)環(huán)境的污染。第二，接種的微生物必須適應(yīng)發(fā)酵床的生理生化環(huán)境。發(fā)酵床溫度在40—50％，堆積時(shí)最高超過(guò)70℃，在此條件下大量微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞死亡，只有耐受高溫的微生物能夠生存或者轉(zhuǎn)化為休眠的孢子等待合適的溫度萌發(fā)。因此，進(jìn)行發(fā)酵床接種菌的篩選時(shí)，必須考慮該菌對(duì)高溫環(huán)境的耐受性。筆者從發(fā)酵墊料的堆積物中篩選具有高效糞污降解能力的優(yōu)勢(shì)菌株，有望獲得適應(yīng)現(xiàn)有發(fā)酵床使用環(huán)境的接種劑。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮鴨糞由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所鴨舍現(xiàn)場(chǎng)采集，鴨糞含水量80％左右，干燥后粗蛋白含量20％—24％。稻殼、鋸末購(gòu)自濟(jì)南周邊農(nóng)村。大腸桿菌DH5a為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌染色體提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，UNIQ—10柱式DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工，其它試劑均為分析純。

1.2 游離氨氣測(cè)定方法

墊料中鋸末與稻殼的比例為1：1，加入發(fā)酵菌劑后，調(diào)節(jié)含水量在50％—60％，添加墊料干重30％的鴨糞后攪拌均勻，堆積厚度為80cm，室溫20—30℃?？刂频傍嗭曫B(yǎng)密度，每天向墊料中排放墊料干重10％的鴨糞，每天均勻翻動(dòng)一次，每周測(cè)定墊料附近空氣的氨氣含量。

墊料剖面挖成后，縱向每隔10cm取墊料樣品，每層采用氨氣比色管法測(cè)5點(diǎn)。即將墊料取樣后，立即置于500ml燒杯中，密封放置1h，以氨氣測(cè)定管測(cè)定燒杯內(nèi)空氣中氨氣含量。

1.3 優(yōu)勢(shì)菌的篩選及計(jì)數(shù)

取發(fā)酵墊料1g，在超凈工作臺(tái)中，加10ml雙蒸水浸泡10min，無(wú)菌紗布過(guò)濾除渣，后將浸泡液采用10倍比遞增稀釋至10^-8，將10^-1……10^-8的不同稀釋度取100μl，分別在LB培養(yǎng)基上均勻涂板，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，37℃恒溫培養(yǎng)36h后，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

1.4 優(yōu)勢(shì)菌16SrDNA的提取與序列測(cè)定方法

細(xì)菌16SrDNA通用引物，由濟(jì)南博尚生物有限公司合成(P1：5′－AGAGTYTGATCCTGGCT－CAG－3′；P2：5′－GGTTACCrTGTrACGACTT－3′)。發(fā)酵床優(yōu)勢(shì)菌以L(fǎng)B液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，采用細(xì)菌染色體提取試劑盒提取染色體DNA，以其為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min；然后94℃變性1min，48℃退火50s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10min。以UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行回收和純化。回收產(chǎn)物與PMD18-T載體體外連接，之后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，將陽(yáng)性菌送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的篩選

堆積過(guò)程中，從墊料表面到50cm處溫度隨墊料深度而升高，而整個(gè)墊料主體發(fā)酵溫度在28—70℃之間。長(zhǎng)時(shí)間堆積發(fā)酵能充分殺滅墊料中的有害微生物。堆積完成后，未檢測(cè)到沙門(mén)氏菌，大腸桿菌檢測(cè)濃度為100個(gè)／g，主要檢測(cè)到一種菌，通過(guò)對(duì)該發(fā)酵墊料進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑱z測(cè)到該種菌的濃度為10⁵個(gè)／g土。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)

在平板上的菌落形態(tài)為表面不規(guī)則、邊緣不整齊的白色菌落。取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)10h，后取50μl接種在4mlLB培養(yǎng)基中，在不同溫度下震蕩培養(yǎng)6h，測(cè)OD₆₀₀值。在堆積發(fā)酵的過(guò)程

中，該菌在較高溫度下，具有良好的生長(zhǎng)與存活能力。在20—44℃之間，發(fā)酵物中大腸桿菌的量高于優(yōu)勢(shì)菌，而在44—54℃之間，發(fā)酵物中優(yōu)勢(shì)菌的量高于大腸桿菌(圖2)。而在75—80℃下保溫12h，該菌的孢子仍能夠萌發(fā)，因此，適應(yīng)堆積發(fā)酵的高溫環(huán)境。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌的鑒定

經(jīng)PCR可測(cè)得優(yōu)勢(shì)菌16SrDNA的大小為1500bp(圖3)，與目的片段大小一致。

測(cè)序結(jié)果如圖4所示，與GenBank中編號(hào)為gb FJ876834.1的枯草芽孢桿菌EBS05菌株的核糖體RNA序列相似性在99％以上，因此判斷本研究分離得到的發(fā)酵床優(yōu)勢(shì)菌株為枯草芽孢桿菌。

2.4 枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑的應(yīng)用效果

采用分離到的枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵劑與無(wú)接種劑的對(duì)照組相比，堆積發(fā)酵過(guò)程中，堆體升溫速度顯著提高，升溫至50℃所需時(shí)間縮短3天左右；以該方法堆積獲得的墊料在28—49天時(shí)，氨氣的排放量降低30％—50％(圖5)。

3 結(jié)論與討論

好的發(fā)酵菌劑能夠耐受堆積發(fā)酵的高溫環(huán)境，并且獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在發(fā)酵墊料的使用過(guò)程中，具有較高的生長(zhǎng)速度和蛋白降解能力，能夠有效縮短堆積時(shí)間，提高發(fā)酵墊料的使用效果。

菌體的篩選通常在需要降解的目的產(chǎn)物附近環(huán)境中進(jìn)行，如何宏勝等(2006)從滇池的淤泥中分離微囊藻毒素的降解菌，鄭惠華等(2009)從牛糞和麥秸堆肥中篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株。尹紅梅等(2010)認(rèn)為產(chǎn)蛋白酶活力較高

的菌株適宜作為發(fā)酵菌劑補(bǔ)充至墊料中。本試驗(yàn)分離到的枯草芽孢桿菌即屬于此類(lèi)菌種。

本試驗(yàn)從鴨糞發(fā)酵堆體中分離篩選到一株鴨糞降解高效枯草芽孢桿菌。其生長(zhǎng)溫度比大腸桿菌高6℃左右，且在溫度較高時(shí)，該菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為孢子能耐受70—80℃的高溫。以該菌為接種劑可縮短堆積發(fā)酵升溫時(shí)間3天左右，28－49天間，發(fā)酵墊料中氨氣的排放量可降低30％－50％。該菌為適宜發(fā)酵床使用環(huán)境的接種菌。