吳則東,王華忠，韓 英

（1.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所/黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

分子生物學的快速發(fā)展，使基于PCR擴增反應的分子標記技術(shù)得到了廣泛的應用，如品種純度的鑒定[1]、QTL定位[2]、分子標記輔助育種、植物遺傳圖譜構(gòu)建[3]、遺傳多樣性評價[4,5,6]、基因定位、雜種優(yōu)勢預測以及比較基因組學[7]等方面。目前的分子標記技術(shù)方法有許多，常使用的有RAPD、AFLP、SSR和SRAP。RAPD作為一種較早的分子標記方法，因其操作簡便而得到了快速的應用，但是由于其穩(wěn)定性、重復性差，產(chǎn)率低等缺點而限制了其發(fā)展應用。而SSR是一種由2～5個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，廣泛分布于整個真核生物基因組的不同座位上，在真核生物中大約每隔10～50 kb就存在1個微衛(wèi)星。SSR擴增得到的多為共顯性標記，但是其引物的開發(fā)費時昂貴而在一定程度上限制了它的發(fā)展。AFLP結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，AFLP以其精確有效得到了廣泛的應用，但此技術(shù)操作復雜，受到專利保護，而且試劑盒價格昂貴，對樣品DNA質(zhì)量要求嚴格，而使其應用受到限制；而SRAP[8]是一種基于PCR的新型標記，由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quiros于2001年在研究蕓薹屬作物中開發(fā)的，SRAP與其他基于PCR的分子標記相比，獨特之處就在于它的引物設計。SRAP引物是針對基因組成的一些特點而設計，即外顯子一般位于富含GC區(qū)域，在不同個體中通常是保守的，而內(nèi)含子、啟動子則處于富含AT區(qū)域，在不同物種甚至不同個體間變異很大。因此正向引物針對序列相對保守的外顯子，使用“CCGG”序列就可以特異擴增出含這些組分的序列；反向引物針對變異大的內(nèi)含子、啟動子和間隔序列，使用“AATT”序列以特異結(jié)合富含AT區(qū)。因此，該標記通過獨特的引物設計優(yōu)先擴增基因組內(nèi)的開放閱讀框（ORFs）。正、反向引物分別與外顯子和啟動子（或內(nèi)含子）區(qū)域配對，因不同物種、不同個體的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[9]。該標記具有簡便高效、產(chǎn)率高、共顯性高、重復性好、易測序、便于克隆目標片段的特點而得到了廣泛的應用，SRAP主要包括模板制備、PCR擴增、產(chǎn)物檢測幾個主要步驟。就產(chǎn)物檢測而言，目前主要用大板變性聚丙烯酰胺凝膠（4%～6%，含8mol/L尿素）電泳分離，采用銀染顯色。也可用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，但可分辨的條帶較少[10]，有的研究者也采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進行銀染檢測[11]。本研究通過對6種甜菜二倍體的SRAP擴增產(chǎn)物變性及非變性膠的檢測進行比較，以期找到一種省時、高效、分辨率高、重復性好的檢測方法，為將來SRAP在甜菜屬的大量應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

甜菜二倍體品系 6 個，代號為 TB001、TB002、TB003、TB004、TB005、TB006，均由黑龍江大學甜菜遺傳改良重點實驗室多倍體課題組提供。2006年4月29日播種，7月8日上午取樣，各材料分別選取5株生長健壯的個體，選取甜菜的中心嫩葉，然后放于小袋中。用冷凍真空干燥機（modnlyo D型）進行干燥，待樣品充分干燥后取出，用離心管密封保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取每個樣品的干粉，采用CTAB法提取基因組DNA。提取的DNA樣品經(jīng)含有0.5μg/L溴化乙錠的 0.8%瓊脂糖電泳檢測 （每個孔道加 1μL樣品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer），結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)檢測（凝膠成像儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)），最后根據(jù)和λDNA檢測濃度的結(jié)果比對，將樣品DNA濃度稀釋為40ng/μL，用于SRAP分析。

1.2.2 SRAP-PCR擴增 SRAP引物采用Li等[8]已發(fā)表的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。通過篩選采用了Me2與Em1的組合，其中正向引物Me2序列為:5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'，反向引物Em1序列為:5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'。PCR（PCR儀為PTC-100）反應程序為，在20μL SSRPCR 反應體系中， 加入 2.5mmol/L 的 dNTP 1μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.1μL，50ng/μL 的引物各 0.8μL，40ng模板DNA，10×PCR Buffer 2μL，最后用重蒸水調(diào)整體系使終體積為20μL，最后加1滴滅菌的石蠟油，蓋上蓋板。反應程序為94℃預變性4 min，94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)，最后72℃延伸 10min，4℃保存。

1.3 PAGE電泳檢測

1.3.1 變性PAGE電泳檢測 （1）電泳：擴增產(chǎn)物4μL加2μL 10倍上樣緩沖液（47.5mL甲酰胺、2.0mL的0.5M EDTA、溴酚藍0.125g、定容到50mL），95℃變性5min，取出后置于冰水混合物中迅速冷卻，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺 57.0g、甲叉雙丙烯酰胺 3.0g、10×TBE 100.0μL、尿素 420.42g、加水至 900mL，攪拌使其完全溶解，定容至1000mL）60mL，加入50μL的TEMED和300μL 10%的過硫酸銨混勻，然后灌膠，垂直板電泳槽和電泳儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)；dNTP、Taq聚合酶、10×PCR Buffer購自百泰克生物技術(shù)有限公司。

（2）銀染方法：①電泳結(jié)束后，輕輕取下長板，將長板放入2L 10%的醋酸溶液中，輕輕搖動30min，蒸餾水中漂洗2次，每次3min；②染色（在2L蒸餾水中加入2g硝酸銀，3mL甲醛）30min；③染色完畢后在蒸餾水中迅速漂洗3～4s，轉(zhuǎn)入預冷的碳酸鈉溶液中（其中含有3mL甲醛，400μL 10mg/mL的硫代硫酸鈉），在搖床上顯影至條帶清晰為止。

1.3.2 非變性PAGE電泳檢測 （1）電泳：20μL體系中加入非變性的雙色上樣緩沖液（非變性指示劑100mL水中加入40g蔗糖，0.125g二甲苯菁，0.125g溴酚藍）6μL，PCR產(chǎn)物14μL，采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行灌膠，其中垂直板電泳槽是北京市六一儀器廠的，型號是DYCZ-30。電泳儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)。

（2）非變性膠的銀染方法：電泳結(jié)束后，將膠輕輕剝下。①固定：將膠置于100mL固定液中（10%無水乙醇，0.5%冰乙酸），脫色搖床上緩慢搖動 6min，2次。②銀染：倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脫色搖床上緩慢搖動 12min。③清洗：倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s。④降低背景：加入0.002%硫代硫酸鈉100mL，脫色搖床上緩慢搖動30s后倒去。⑤顯色：加入100mL顯色液（1.5%氫氧化鈉，0.4%甲醛），脫色搖床上緩慢搖動至肉眼看到清晰的DNA條帶。⑥照相：用數(shù)碼相機進行記錄。

圖1 非變性膠

圖2 變性膠

2 結(jié)果與分析

比較圖1和圖2（其中的序號對應甜菜樣品的序號）可知，二者均為銀染，雖然電泳過程不同，染色方法不同，但從圖中我們可以看出，二者在主帶上沒有差異，僅在一些弱帶上略有不同，其分辨率差異不大，但相比較而言，非變性膠可以在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，而且易操作。

3 討論

甜菜做為小作物，國內(nèi)在基礎方面的研究比較薄弱，尤其是在分子水平上的研究則更是較少，近年來，國家加大了甜菜科研的投資力度，國家甜菜產(chǎn)業(yè)體系建設項目的大額投入使得甜菜分子生物學方面的進一步研究成為可能，如甜菜品種純度的鑒定、QTL定位、分子標記輔助育種以及甜菜遺傳圖譜的構(gòu)建等等，這些都需要利用分子標記技術(shù)，而目前分子標記技術(shù)實用性能較好的要數(shù)SRAP，過去科研工作者在做SRAP分子標記的時候，經(jīng)常使用的是變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用伯樂的垂直板灌膠，這種灌膠的方法需要涂親和與剝離，灌膠的過程也較為復雜，PCR的產(chǎn)物也需要變性處理，銀染的過程也較為復雜，需要使用搖床，整個流程下來需要1個多小時的時間，具有較高的專業(yè)性；而非變性膠的灌制則比較簡單，只需要用瓊脂糖封底，凝固后稍微傾斜一下把配好的膠倒到兩個板子中間，再插上梳子，等待凝固，凝固后拔掉梳子，加緩沖液點樣即可，非變性膠的顯色過程也比較簡單，因為膠比較小，所以只需要一個小的搪瓷盤，大約在30min之內(nèi)即可完成。而通過對非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色發(fā)現(xiàn)，這兩種方法顯示的結(jié)果分辨率差異不大，但由于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有灌膠簡單易學，顯色時間短，節(jié)省藥品等特點，可以作為今后甜菜SRAP電泳及顯色的首選方法。

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