接偉光，蔡柏巖,2，白 莉

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱150086；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

AM真菌是自然界中普遍存在的一種寡營養(yǎng)活體微生物，能夠侵染80%以上的陸生植物根系[1-3]。AM真菌具有能夠提高植物對營養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)植物生長，提高植物抗病性，增強(qiáng)植物對鹽堿和污染物毒害的耐性，增加作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)等作用[4-6]。近年來，AM真菌在農(nóng)作物上的應(yīng)用已受到國內(nèi)外廣大學(xué)者的重視，有關(guān)AM真菌的接種效應(yīng)已在不同農(nóng)作物的研究中得到證實(shí)。

甜菜是我國重要的糖料作物之一，在我國已有上百年的栽培歷史，但長期以來甜菜在產(chǎn)質(zhì)量及抗病方面沒有突破性的研究進(jìn)展，使我國的甜菜科研水平整體落后于發(fā)達(dá)國家[7,8]。目前，有關(guān)菌根方面的研究報(bào)道較多，但在甜菜方面的研究卻少有報(bào)道。本文將傳統(tǒng)形態(tài)分類鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對甜菜根際土壤AM真菌進(jìn)行鑒定及對AM真菌侵染甜菜根系情況進(jìn)行分子檢測，旨在為進(jìn)一步開展甜菜AM真菌的基礎(chǔ)研究及AM真菌在甜菜上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2008年7月30日從哈爾濱工業(yè)大學(xué)糖業(yè)研究所試驗(yàn)田隨機(jī)選取10株長勢良好的甜菜，每株作為1個(gè)樣地，每個(gè)樣地按東西南北4個(gè)方位，去除表層5cm厚的雜物，采集10～20cm土層土樣約1kg，同時(shí)收集其中的甜菜根系。將10個(gè)樣地采集的甜菜根系及根圍土壤分別充分混勻，各自組成1個(gè)混合樣品，土樣于陰涼處自然風(fēng)干后，置于陰涼處保存?zhèn)溆?。根樣帶回?shí)驗(yàn)室洗凈后，立即提取DNA后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 AM真菌孢子形態(tài)鑒定 采用濕篩傾析-蔗糖離心法[9]分離甜菜根圍土壤AM真菌孢子，于解剖鏡下觀察其顏色并測定孢子大小、孢壁層次和厚度等，并初步分類。

1.2.2 AM真菌單孢DNA的提取 依據(jù)蔡柏巖等[10]描述的方法稍加修改，吸取單個(gè)AM真菌孢子，至少用無菌水漂洗5次，將其放入無菌的1.5mL離心管中，加入40μL TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0），將其充分破碎后，加入 15μL 20%Chelex-100。 沸水浴 10min，冰浴 5min，15000r/min 離心 5min，吸取上清液到新的離心管中，置于-80℃保存，備用。

1.2.3 Nested-PCR 將上述AM真菌單孢DNA作為第一次PCR擴(kuò)增模板，第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物100倍稀釋后作為第二次PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行Nested-PCR。引物序列（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

第一次 PCR 擴(kuò)增， 反應(yīng)體系為 20μL：10×PCR 緩沖液 2μL，2.5mmol/L dNTP 1.6μL，25mmol/L MgCl22μL，1.0μmol/L 的引 物 ITS1 和 NDL22 各 2μL，5 U/μL Taq polymerase 0.2μL， 模板 DNA 2.0μL，ddH2O 8.2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 3min；93℃變性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1min，30個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸5min。第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系僅將引物對改為LR1-NDL22。反應(yīng)程序僅將退火溫度改為53℃。取兩次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 Nested-PCR引物

1.2.4 目標(biāo)DNA片段的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 將陽性克隆產(chǎn)物與pGM-T（TIANGEN公司）載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，檢測重組子，將陽性克隆菌測序。測序結(jié)果提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，將擴(kuò)增序列與GenBank中近緣種的序列進(jìn)行缺省參數(shù)的對位排列（alignment），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 AM真菌侵染甜菜根系檢測 根據(jù)測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，設(shè)計(jì)相應(yīng)AM真菌種特異性引物，檢測AM真菌侵染甜菜根系情況。

提取根樣DNA，方法同AM真菌單孢DNA的提取。第一次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同AM真菌單孢DNA Nested-PCR中的第二次PCR；第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系僅將第一次PCR擴(kuò)增中使用的真核生物通用引物對改為AM真菌種特異性引物對。反應(yīng)程序僅將退火溫度改為58℃。分別取兩次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并進(jìn)行blast分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌孢子形態(tài)特征

從甜菜根圍土壤中分離出大量AM真菌孢子，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，均為摩西球囊霉Glomus mosseae（T.H.Nicolson&Gerd.）Gerd.&Trappe,Mycologia Memoir,5:76,1974。其形態(tài)特征如下：孢子在土壤中單生、根內(nèi)生或孢子果內(nèi)形成；圓形，近圓形，直徑180～210μm，淡黃色至黃褐色；孢壁3層，L1和L2無色透明，L3淺黃至黃褐色。連孢菌絲單根，連點(diǎn)漏斗狀。標(biāo)本號：DFAM。標(biāo)本保存于黑龍江東方學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2.2 AM真菌單孢DNA Nested-PCR

由于AM真菌DNA的含量較低，經(jīng)第一次PCR擴(kuò)增后，難以在瓊脂糖凝膠中觀察到相應(yīng)AM真菌的DNA帶型。經(jīng)擴(kuò)增序列覆蓋核糖體25S rDNA中D1/D2可變區(qū)域的引物對LR1-NDL22進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增后，AM真菌相應(yīng)DNA序列被特異性地?cái)U(kuò)增出來，片段大小約為750bp（圖1）。可見，通過Nested-PCR的放大作用，能夠很好地將含量較低的靶模板DNA特異性擴(kuò)增出來。

2.3 AM真菌25S rDNA D1/D2區(qū)測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果表明，擴(kuò)增的DNA序列全長為787bp，在GenBank中的登錄號為FJ790677。為顯示供試菌株與已知AM真菌之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位，將測得序列在GenBank中進(jìn)行同源序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。菌株DFAM序列與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的14個(gè)AM真菌進(jìn)行比較，其25S rDNA D1/D2區(qū)序列與球囊霉屬Glomus的7個(gè)種和1個(gè)未培養(yǎng)真菌都有較高的序列同源性，其中與Glomus mosseae（DQ273793）的同源性最高，為98%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，DFAM與Glomus mosseae能聚為一簇。綜合形態(tài)學(xué)特征及25S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，將DFAM鑒定為摩西球囊霉G.mosseae。

2.4 甜菜菌根內(nèi)AM真菌的分子檢測

利用AM真菌種特異性引物5.25[13]：5′-ATCAACCTTTTGAGCTCG-3′與 引 物 NDL22配對，能夠特異性地檢測G.mosseae侵染甜菜根系情況。

第一次PCR擴(kuò)增，結(jié)果與AM真菌單孢DNA的第一次PCR擴(kuò)增結(jié)果類似，難以在瓊脂糖凝膠中觀察到大約750bp的AM真菌25S rDNA D1/D2區(qū)帶型。經(jīng)第二次PCR擴(kuò)增后，檢測到編號為DFAM的相應(yīng)目的片段，約為370bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。該目的片段經(jīng)測序及blast分析，證實(shí)為AM真菌特異性條帶，確定摩西球囊霉G.mosseae侵染甜菜根系。

3 討論

對侵染植物根系的AM真菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是菌根研究的基礎(chǔ)，對于收集、保護(hù)及利用這類微生物資源具有重要的意義。目前，AM真菌的分子鑒定工作，國外已有研究報(bào)道，國內(nèi)開展得則很少[10,14]。本文應(yīng)用傳統(tǒng)AM真菌鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合對甜菜根圍AM真菌進(jìn)行鑒定，能夠較全面、準(zhǔn)確地對其進(jìn)行鑒定，同時(shí)提高了試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

由于AM真菌單孢和菌根中AM真菌DNA含量低，本試驗(yàn)在提取DNA時(shí)使用了能夠整合多價(jià)金屬離子，尤其是選擇性整合二價(jià)離子的Chelex-100化學(xué)整合樹脂。該樹脂含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，比普通離子交換劑具有更高的金屬離子選擇性和較強(qiáng)的結(jié)合力，能結(jié)合許多可能影響一些分析的其他外源物質(zhì)。通過離心除去Chelex-100顆粒，使這些與Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，防止結(jié)合到Chelex-100中的抑制劑或雜質(zhì)帶到PCR反應(yīng)中，影響下一步的DNA分析，并通過結(jié)合金屬離子，防止DNA降解，保證了提取DNA的質(zhì)量。

本研究從甜菜根圍土壤中分離到G.mosseae，并且采用AM真菌種特異性引物，利用具有較高靈敏性的Nested-PCR技術(shù)對甜菜根系A(chǔ)M真菌DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，檢測到目標(biāo)帶，證明G.mosseae侵染甜菜根系，為今后甜菜功能菌群及甜菜種植的進(jìn)一步深入研究奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，再次驗(yàn)證了Nested-PCR技術(shù)對研究野外條件下的AM真菌生態(tài)學(xué)極為有益。

[1]Bharadwaj D P,Lundquist P O,Alstrom S,et al.Impact of plant species grown as monocultures on sporulation and root colonization by native arbuscular mycorrhizal fungi in potato[J].Applied Soil Ecology,2007,35（1）:213-225.

[2]Grigera M,Rhae A,Drijber,Brian J,et al.Increased abundance of arbuscular mycorrhizal fungi in soil coincides with the reproductive stages of maize[J].Soil Biology and Biochemistry,2007,39（7）:1401-1409.

[3]Violi H A,Alejandro F,Wright S F,et al.Disturbance changes arbuscular mycorrhizal fungal phenology and soil glomalin concentrations but not fungal spore composition in montane rainforests in Veracruz and Chiapas,Mexico[J].Forest Ecology and Management,2008,254:276-290.

[4]Dupré H,Joner E J,Leyval C,et al.Role and influence of mycorrhizal fungi on radiocesium accumulation by plants[J].Journal of Environmental Radioactivity,2008,99（5）:785-900.

[5]Bedini S,Avio L,Argese E,et al.Effects of long-term land use on arbuscular mycorrhizal fungi and glomalin-related soil protein[J].Agriculture,Ecosystems and Environment,2007,120:463-466.

[6]于永光，趙斌.不同pH水平下兩種菌根真菌對紫云英生長的影響及其相互作用[J].菌物學(xué)報(bào),2008,7（2）:209-216.

[7]吳則東，王華忠，韓英.甜菜SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國糖料,2008（1）:11-17.

[8]王燕飛，陳麗君，劉華君，等.我國甜菜誘變育種方法研究進(jìn)展[J].中國糖料,2008（4）：66-68.

[9]劉潤進(jìn)，陳應(yīng)龍.菌根學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2007,1-404.

[10]蔡柏巖，接偉光，葛菁萍，等.黃檗根圍叢枝菌根（AM）真菌的分離與分子鑒定[J].菌物學(xué)報(bào),2008,27（6）:884-893.

[11]White T J,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[A].PCR protocols,a guide to methods and applications[C].San Diego:Academic Press,1990,315-322.

[12]Van Tuinen D,Zhao B,Gianinazzi-Pearson V.PCR in studies of AM fungi:from primers to application[C].In Varma AK （ed.）Mycorrhiza manual.Springer Verlag,Heidelberg,1998,387-399.

[13]Van Tuinen D,Jacquot E,Zhao B,et al.Characterization of root colonization profiles by a microcosm community of arbuscular mycorrhizal fungi using 25S rDNA-targeted nested PCR[J].Molecular Ecology,1998,7（7）:879-887.

[14]接偉光，蔡柏巖，葛菁萍，等.黃檗叢枝菌根真菌鑒定[J].生物技術(shù),2007,17（6）:32-35.