毛逸嶸, 張 易, 張紅霞, 翁 亮, 張紅鋒

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物的制備與抑制HMEC遷移的作用

毛逸嶸, 張 易, 張紅霞, 翁 亮, 張紅鋒

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062)

灰樹(shù)花(Grifolafondose)高濃縮精粉經(jīng)熱水提取,95%乙醇沉淀,獲得水溶性灰樹(shù)花粗多糖 GFP.GFP依次經(jīng)DEAE-cellulose陰離子交換樹(shù)脂及SephadexG-100葡聚糖凝膠分離純化得到 GFP1-F,GFP1-M及 GFP1-L3種不含蛋白質(zhì)的葡聚糖純品,其分子量依次為1.09×105,1.93×104和2.76×103Da.采用吡啶-氯磺酸法對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化修飾,硫酸酯化衍生物 GFP1-FS,GFP1-MS及 GFP1-LS的紅外光譜分析表明,3個(gè)樣品均在1236.90cm-1和811.81cm-1有硫酸酯鍵的特征吸收峰,13CNMR證明C-6上的羥基被酯化.并且 GFP1-FS的硫酸酯化程度最高,其取代度DS為1.07;GFP1-MS與 GFP1-LS的硫酸酯化程度相當(dāng),DS分別為0.66和0.61.劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)1000μg/mL的 GFP1-FS,GFP1-MS及 GFP1-LS處理24h后向劃痕區(qū)遷移的細(xì)胞數(shù)明顯減少,分別為對(duì)照組的73.33%,34.17%和67.21%,均具有抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)遷移的活性,其中 GFP1-MS的效果最為顯著,這可能與GFP1-MS所具有的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)有關(guān).

灰樹(shù)花; 葡聚糖; 硫酸酯化衍生物; 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞; 遷移

0 引 言

在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的一系列過(guò)程中,血管的形成可以為腫瘤組織提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,還為腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移提供通路[1],因此抑制腫瘤血管的形成對(duì)于抗腫瘤具有重要意義.腫瘤血管的形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜成分和腫瘤細(xì)胞等多種成分相互作用的結(jié)果,腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)激活內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶降解基底膜,促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移.目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腫瘤血管內(nèi)皮是由周圍正常組織的血管內(nèi)皮增生、遷移和分化形成的[2],它是鄰近腫瘤細(xì)胞的組織中的正常內(nèi)皮細(xì)胞,遭受腫瘤微環(huán)境的刺激,持續(xù)不斷的增生,發(fā)生形態(tài)和功能的變化而形成腫瘤血管內(nèi)皮.因此血管內(nèi)皮細(xì)胞成為抗腫瘤藥物研究的靶點(diǎn)之一.本文將從灰樹(shù)花(Grifolafrondosa)多糖的硫酸酯化衍生物對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)遷移能力的影響,來(lái)研究其抗腫瘤活性.

已有研究表明,一些多糖,如昆布多糖[3]及巖藻衣多糖[4]具有抑制血管生成的作用.KojoanagiS等[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,天然的巖藻衣多糖和過(guò)硫酸酯化巖藻衣多糖都能阻斷VEGF165與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的結(jié)合,從而抑制 HUVEC的生長(zhǎng)、遷移、成管和新生血管的生成,其中硫酸酯化巖藻衣多糖的抑制作用更加明顯.目前研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)硫酸酯化修飾的灰樹(shù)花多糖具有顯著的抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤及抗凝血的活性[5-8].灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在增強(qiáng)免疫功能進(jìn)而間接殺滅腫瘤細(xì)胞,或直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)兩個(gè)方面[6,9].史寶軍等[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物 SGAP-P能抑制腫瘤細(xì)胞SGC-7901的增殖,并促使細(xì)胞凋亡.關(guān)于灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響尚未見(jiàn)報(bào)道.本文從灰樹(shù)花高濃縮精粉水提物中獲得不含蛋白且主要含有α糖苷鍵的3個(gè)葡聚糖組分,并對(duì)其進(jìn)行硫酸酯化修飾,利用劃痕法(Scratching assay)初步探討灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹(shù)花高濃縮精粉由上海童童食品有限公司提供;Cellulose DE-52為Whatman產(chǎn)品;Sephadex G-100為上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司產(chǎn)品;T系列Dextran標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖為Pharmacia產(chǎn)品;氯磺酸、吡啶、甲酰胺、三氟乙酸(TFA)、硼氫化鈉和乙酸酐等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,用含20%胎牛血清的Mcdb131培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng).

紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)UV-VIS 8500 spectrophotometer(上海天美科學(xué)儀器有限公司);HPLC色譜儀 1100化學(xué)工作站 (Beckman Corporation),色譜柱為 TSK-GEL G4000PW(XL)(TOSOH);氣質(zhì)聯(lián)用分析儀 Thermo FINNIGAN (Thermo Electron Corporation),氣相色譜柱為Rtx-5MS(15m×0.25mm×0.25μm);紅外光譜分析儀NICOLET NEXUS 670 FT-IR(Thermo Electron Corporation);核磁共振波譜分析儀Bruker DRX500 (Bruke Corporation).

1.2 灰樹(shù)花多糖的分離與純化

灰樹(shù)花多糖的分離純化流程如圖1所示.灰樹(shù)花高濃縮精粉100g溶于1L開(kāi)水中,趁熱過(guò)濾,加入3倍體積的95%乙醇,4℃靜置24h,傾去上清液,沉淀依次用兩倍體積的無(wú)水乙醇和丙酮洗滌以脫去水分,40℃下烘干得灰樹(shù)花粗多糖 GFP39.829g,得率為39.8%.取一定量 GFP溶于10倍體積的水中,離心除去不溶物后,上DEAE-cellulose陰離子交換柱.糖類化合物分子中含有許多醇羥基而具有弱酸性和極性,可與強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂發(fā)生離子交換作用而被吸附.中性多糖不與吸附劑交換而自然流出,酸性多糖含有羧基,吸附在纖維素離子交換樹(shù)脂上,可用NaCl梯度溶液作為洗脫劑將酸性多糖從樹(shù)脂上洗脫下來(lái),達(dá)到酸性多糖與中性多糖分離提純的目的.因此依次用水、0.1,0.2,0.4和0.8mol/LNaCl溶液洗脫,苯酚-濃硫酸法檢測(cè)各管糖含量,合并各流分.減壓濃縮后對(duì)蒸餾水透析(透析袋型號(hào)MD45(2000)),內(nèi)液冷凍干燥,得到水洗組分 GFP1,為中性多糖,以及0.1mol/L NaCl洗脫組分 GFP2為酸性多糖,0.2～0.8mol/LNaCl洗脫時(shí)未得到其它組分(見(jiàn)圖2).GFP1溶于0.1g/L疊氮化鈉溶液中,上SephadexG-100柱(2.6cm×70cm),經(jīng)0.1g/L疊氮化鈉溶液洗脫,依次得到 GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L3個(gè)多糖組分.

1.3 多糖純度及分子量的測(cè)定

將 GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L配成1mg/mL水溶液,400～200nm紫外掃描,觀察在280nm處是否有紫外吸收,檢測(cè)蛋白含量.

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定多糖分子量.HPLC色譜儀由Beckman Coulter System Gold508自動(dòng)進(jìn)樣器,Gold 126 gradient HPLC泵及 Sedex 75 ELSD檢測(cè)器構(gòu)成.色譜柱為 TSK-GEL G4000 PW(XL),流動(dòng)相為0.003mol/LNH4AC,流速0.5mL/min,樣品濃度為0.2%(w/v),進(jìn)樣量10μL.用 T系列Dextran(T500,T70,T40和 T10,Pharmacia)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lgM=-0.4136x+12.25,根據(jù)分子量與保留時(shí)間RT的關(guān)系,即可算出多糖的平均分子量.

1.4 糖基組成分析

取 GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L各2mg,溶于4mL2mol/LTFA中,110℃下封管水解1.8h,加甲醇反復(fù)減蒸發(fā)縮至干.產(chǎn)物溶于2mLH2O中,取5μL進(jìn)行TLC分析確定是否含有糖醛酸(如含糖醛酸會(huì)顯示粉紅色斑點(diǎn)).剩余部分加入25mgNaBH4,室溫下還原2h,間歇振蕩,用乙酸中和至無(wú)氣泡產(chǎn)生,反復(fù)加甲醇減壓蒸發(fā)至完全干燥.于100℃下干燥15min,加入2mL乙酸酐,100℃反應(yīng)1h.反復(fù)加甲苯減壓蒸發(fā)除去乙酸酐,產(chǎn)物經(jīng)氯仿萃取,水洗4次,氯仿層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥,濃縮至50μL后進(jìn)行 GC-MS分析[11].

氣相分析儀為FINNIGAN Trace GC Ultra,質(zhì)譜分析儀為 FINNIGAN Trace DSQ.氣相色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱(15m×0.25mm×0.25μm),進(jìn)樣量1μL,流速1mL/min.溫度設(shè)定從120℃到250℃,10℃/min,在到達(dá)250℃后保持10min.

圖1 灰樹(shù)花多糖分離純化流程圖Fig.1 Scheme for isolation and purification of GFP1-F , GFP1-M and GFP1-L

圖2 GFP在DEAE-cellulose上的洗脫圖Fig.2 Elution profile of GFP on DEAE-cellulose column

1.5 硫酸酯化修飾

采用吡啶-氯磺酸法對(duì)GFP1-F,GFP1-M及 GFP1-L進(jìn)行硫酸酯化修飾[11],各取50mg加入5mL甲酰胺,室溫下磁力攪拌15min,加入1.33mL吡啶,然后逐滴加入0.67mL氯磺酸,室溫下攪拌2h.反應(yīng)液于40℃下保溫4h,之后加入10mL甲醇,最后用2.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0.反應(yīng)液對(duì)水透析,經(jīng)濃縮、凍干后即得相應(yīng)的硫酸酯化衍生物,分別命名為GFP1-FS,GFP1-MS和GFP1-LS.

1.6 硫酸基含量測(cè)定及取代度(DS)計(jì)算

硫酸基含量測(cè)定采用氯化鋇-明膠濁度法[12].精確量取0,0.04,0.08,0.12,0.16和0.2mL標(biāo)準(zhǔn)硫酸鈉溶液于具塞試管中,補(bǔ)加1mol/LHCl至體積為0.2mL,分別加入3.8mL3%三氯乙酸(w/v)和1mL氯化鋇-明膠試劑,混勻后于室溫下靜置15min,以不含標(biāo)準(zhǔn)液的0號(hào)管作為空白管,測(cè)定360nm下的吸光度.以含硫的質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線.

稱取各硫酸酯化衍生物4.5mg于具塞試管中,加入1mol/LHCl4.5mL,100℃下水解2.5h,冷卻至室溫后取0.2mL進(jìn)行測(cè)定,后續(xù)操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定過(guò)程.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出硫的含量S%.

樣品取代度的計(jì)算公式為:DS=1.62×S%/(32-1.02×S%);S%為S含量.

1.7 紅外光譜分析

取1mg樣品,溴化鉀壓片,于4000～500cm-1進(jìn)行紅外掃描.

1.8 核磁共振分析

取 GFP1-F,GFP1-M,GFP1-L,GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS各40mg,溶于0.5mLD2O中,置于Φ5mm核磁管中,TMS作內(nèi)標(biāo),500MHz核磁儀于室溫下測(cè)定.

1.9 血管內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)(劃痕法)

利用劃痕法研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)[13].HMEC細(xì)胞以8×105/孔接種至6孔板中,細(xì)胞在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)1d,至細(xì)胞長(zhǎng)滿90%.換成含1%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理12h.然后,用1mL的滅菌槍頭進(jìn)行十字劃痕,劃痕后用D-Hank’s液潤(rùn)洗兩次,洗去浮起的細(xì)胞.每孔加入1mL含1%胎牛血清的培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入灰樹(shù)花多糖及其硫酸酯化衍生物(用含1%血清的培養(yǎng)基配制),終濃度為1mg/mL.將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱,37℃5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24h.

劃痕后即刻在倒置相差顯微鏡下拍照,標(biāo)記劃痕寬度.培養(yǎng)24h后再次拍照,人工計(jì)數(shù)遷移至劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù).以空白對(duì)照組表示為100%,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比得出遷移細(xì)胞數(shù)的相對(duì)百分率.

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)初探

2.1.1 多糖的分離與純化

經(jīng)過(guò)沸水提取,95%乙醇沉淀,DEAE Cellulose陰離子交換色譜分離,得到水洗組分GFP1.再經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠色譜純化,依次獲得3個(gè)組分——GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L.用碘-碘化鉀試劑檢測(cè)均不顯藍(lán)色,表明其不為淀粉.

HPGPC結(jié)果顯示,GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L均表現(xiàn)為對(duì)稱的單峰(見(jiàn)圖3),說(shuō)明三者都為均一組分.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣品的保留時(shí)間,計(jì)算平均分子量,GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L的分子量依次為1.09×105,1.93×104和2.76×103Da(見(jiàn)表1).

紫外掃描的結(jié)果顯示,GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L在280nm處均無(wú)紫外吸收,說(shuō)明所得到的3個(gè)多糖組分都不含有蛋白質(zhì).

2.1.2 糖組成分析

GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L3個(gè)樣品經(jīng) TFC完全水解后,TLC分析未看到粉紅色斑點(diǎn),表明均不含有糖醛酸,為中性多糖.GC-MS分析結(jié)果表明,3個(gè)樣品的譜圖均顯示一個(gè)單峰,與標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖的譜圖對(duì)比,3個(gè)樣品均完全由葡萄糖組成,即為葡聚糖(見(jiàn)圖4).

圖3 GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L的HPGPC圖譜Fig.3 Fig. 3 HPGPC profile of GFP1-F , GFP1-M and GFP1-L

表1 GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L在 HPGPC檢測(cè)中的保留時(shí)間及相應(yīng)的分子量Tab.1 The retaining time and molecular weight of GFP1-F , GFP1-M & GFP1-L in HPGPC

2.1.3 GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L結(jié)構(gòu)分析

紅外光譜顯示 GFP1-F在847.59cm-1處有吸收峰,1HNMR譜顯示 GFP1-F的 H1信號(hào)在δ5.407ppm,表明GFP1-F為α葡聚糖.13CNMR結(jié)果顯示,C-1信號(hào)在δ99.702ppm,表明為α-1,4-糖苷鍵.在δ60.370ppm有一個(gè)較強(qiáng)的C-6信號(hào),在δ69.224ppm有一個(gè)較弱的C-6信號(hào),說(shuō)明有極少量的 C-6取代.C-4,C-3,C-5及 C-2信號(hào)分別在δ76.658ppm,δ72.788ppm,δ71.442ppm及δ70.288ppm(見(jiàn)圖5a).由此初步判斷GFP1-F具有α-1,4-糖苷鍵的主鏈和極少量α-1,6-糖苷鍵的分支.

1HNMR結(jié)果顯示 GFP1-M 的 H1信號(hào)有3個(gè),分別在δ5.343ppm,δ5.059ppm和δ4.917ppm.前兩個(gè)信號(hào)均大于5ppm,屬于α構(gòu)型的特征,而第3個(gè)信號(hào)小于5ppm,屬于β構(gòu)型的特征[11],因此,GFP1-M的結(jié)構(gòu)中α和β兩種構(gòu)型同時(shí)存在.GFP1-M的13CNMR結(jié)果顯示,C-1信號(hào)共有 4個(gè),依次在δ98.953ppm,δ99.173ppm,δ100.895ppm 和δ103.546ppm,前3個(gè)信號(hào)屬于α構(gòu)型,為α-1,4-糖苷鍵;而第4個(gè)信號(hào)與β-1,4-葡聚糖的C-1信號(hào)相吻合[11],進(jìn)一步表明 GFP1-M含有α和β兩種構(gòu)型的糖苷鍵.C-6信號(hào)出現(xiàn)在δ62.019ppm和δ68.085ppm,說(shuō)明 C-6位有取代.C-4,C-3,C-5和 C-2信號(hào)分別在δ78.117ppm,δ74.359ppm,δ72.659ppm和δ71.439ppm(見(jiàn)圖5b).由此初步判斷GFP1-M具有α-1,4-糖苷鍵的主鏈和少量α-1,6-糖苷鍵的分支以及β-1,4-糖苷鍵的分支.

圖4 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖,GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L的糖組成分析 GC圖Fig.4 GC pattern of sugar composition analysis of GFP1-F , GFP1-M & GFP1-L

紅外光譜分析結(jié)果顯示,GFP1-L在848.34cm-1處有吸收峰,1HNMR譜結(jié)果顯示GFP1-L的 H1信號(hào)在δ5.332ppm,表明 GFP1-L為α葡聚糖.GFP1-L的13CNMR結(jié)果顯示C-1信號(hào)在δ101.252ppm,C-6信號(hào)在δ61.688ppm,C-4,C-3,C-5和C-2信號(hào)分別在δ79.067ppm,δ75.252ppm,δ73.958ppm和δ71.195ppm(見(jiàn)圖5c),表明GFP1-F為α-1,4-連接的葡聚糖,但用碘-碘化鉀檢測(cè)無(wú)顯色反應(yīng),說(shuō)明不是直鏈的1,4葡聚糖,可能存在支鏈結(jié)構(gòu).ShiLei[14]等分離到一種帶有1,6分支結(jié)構(gòu)的α-1,4-葡聚糖,其13CNMR譜圖與GFP1-L的非常相似,雖然這種葡聚糖中含有1,6糖苷鍵,但并未出現(xiàn)C6位上發(fā)生取代的信號(hào),這可能與1,6糖苷鍵在整條糖鏈中所占的比例有關(guān),根據(jù)文獻(xiàn)[12]一般認(rèn)為取代基含量少于5%,還是不能出現(xiàn)信號(hào)的.據(jù)此推測(cè),GFP1-L可能是含有極少量1,6連接分支結(jié)構(gòu)的α-1,4葡聚糖.

2.2 硫酸酯化衍生物制備

2.2.1 硫酸酯化程度分析

GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L經(jīng)硫酸酯化后的含硫量及DS如表2所示.3個(gè)樣品中,GFP1-FS的硫酸酯化程度最高,DS為1.07;而 GFP1-MS與 GFP1-LS的硫酸酯化程度相當(dāng),DS分別為0.66和0.61.

表2 GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS的硫酸酯化程度Tab.2 Degrees of substitution ( DS) of GFP1-FS , GFP1-MS & GFP1-LS

2.2.2 硫酸酯化衍生物的紅外光譜分析

比較硫酸酯化前后的紅外光譜可以看出,3種硫酸酯化產(chǎn)物的紅外光譜均在1236.90cm-1顯示出不對(duì)稱的S=O鍵振動(dòng)吸收峰,在811.81cm-1顯示出對(duì)稱的C-O-S伸縮振動(dòng)吸收峰,這些都是硫酸酯鍵的特征吸收峰.同時(shí),還可以看出在3400cm-1附近的羥基吸收峰有所降低,表明部分羥基已被酯化,證明GFP1-F,GFP1-M和GFP1-L已修飾形成硫酸酯化衍生物 GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS.

2.2.3 硫酸酯化衍生物的13CNMR分析

對(duì)比GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L硫酸酯化前后的13CNMR譜圖,3個(gè)樣品經(jīng)過(guò)硫酸酯化修飾后C-6信號(hào)均由修飾前的δ61ppm左右移至δ66ppm左右的位置,且硫酸酯化前在δ61ppm的信號(hào)均完全消失(見(jiàn)圖5),表明 GFP1-F,GFP1-M和 GFP1-L上原先未發(fā)生取代的C-6上幾乎都與硫酸基成酯.

另外,GFP1-FS與 GFP1-LS的13CNMR譜圖顯示,這兩個(gè)樣品的C-1信號(hào)均向高場(chǎng)位移大約4ppm,提示C-2上可能發(fā)生硫酸基的取代,由此對(duì)β碳增進(jìn)屏蔽,使其信號(hào)向高場(chǎng)方向移動(dòng)[15].同時(shí)在1HNMR譜圖上看到 H1信號(hào)向低場(chǎng)位移大約0.5ppm,還在13C NMR譜圖上看到GFP1-FS與GFP1-LS的C-3信號(hào)為兩個(gè)小峰,即向低場(chǎng)方向裂解出一個(gè)峰.這些都可能是受C-2上硫酸基取代的影響而出現(xiàn)的.但是C-2位上羥基的硫酸酯化修飾的相當(dāng)微弱的.

從硫酸酯化產(chǎn)物的13CNMR結(jié)果可以看出,α-1,4葡聚糖的硫酸酯化反應(yīng)中C-6位上羥基的反應(yīng)活性遠(yuǎn)大于C2位置上的羥基,甚至C-6位上羥基的可以全部被硫酸酯化修飾,這與前人的研究結(jié)果一致[16].

2.3 硫酸酯化衍生物對(duì) HMEC細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕法是一種模擬體外愈傷模型設(shè)計(jì)的考察細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的實(shí)驗(yàn),可從二維水平上衡量藥物對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響[12].本文分別用1000μg/mL的 GFP1-F,GFP1-M及GFP1-L作用 HMEC細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均向劃痕區(qū)爬行,組間沒(méi)有顯著差異(照片未列在本文中),說(shuō)明3個(gè)多糖組分沒(méi)有抑制 HMEC遷移的作用.

分別用1000μg/mL的 GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS作用 HEMC細(xì)胞24h,鏡檢記錄HMEC向劃痕區(qū)遷移的細(xì)胞數(shù).由圖6可以看出,Control組的劃痕區(qū)基本上已經(jīng)被爬出的 HEMC細(xì)胞所占據(jù).與此相比,經(jīng) GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS處理后向劃痕區(qū)遷移的細(xì)胞數(shù)明顯減少,分別為對(duì)照組的73.33%,34.17%和67.21%,其中 GFP1-MS對(duì)HMEC細(xì)胞遷移的抑制效果最為顯著(P<0.01),比 GFP1-FS與 GFP1-LS的抑制效果強(qiáng)一倍,而且細(xì)胞爬出的距離也相對(duì)最短.

圖5 GFP1-F,GFP1-M,GFP1-L及其硫酸酯化衍生物的13CNMR譜圖Fig.5 13C NMR spect rums of GFP1-F , GFP1-M , GFP1-L and their sulfated derivatives

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3個(gè)灰樹(shù)花多糖樣品對(duì) HEMC細(xì)胞遷移沒(méi)有影響,而其硫酸酯化衍生物具有明顯的抑制細(xì)胞遷移的作用.ChengJJ[17]等利用劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1000μg/mL的樟芝多糖能抑制牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)的遷移運(yùn)動(dòng).KojoanagiS等[4]在 Transwell小室實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),天然的巖藻衣多糖和過(guò)硫酸酯化巖藻衣多糖均能抑制 HUVEC的遷移,100μg/mL巖藻衣多糖處理后遷移細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的75.2%,100μg/mL過(guò)硫酸酯化巖藻衣多糖處理后遷移細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的56.1%.天然的巖藻衣多糖本身具有一定的硫酸基團(tuán),其含硫量為32.6%,由此表現(xiàn)出抑制細(xì)胞遷移的活性,而過(guò)硫酸酯化巖藻衣多糖的含硫量為56.7%,其抑制作用則更為明顯.本文制備的灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物 GFP1-FS,GFP1-MS和 GFP1-LS的含硫量分別為12.6%,9.23%和8.76%,以 GFP1-MS的抑制效果最為顯著,由于 GFP1-MS是三者中分支結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的,所以結(jié)果提示,灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用不僅與硫酸酯化修飾有關(guān),還可能與 GFP1-MS所具有的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)有關(guān).

圖6 灰樹(shù)花多糖硫酸酯化衍生物作用24h對(duì) HMEC細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 The effect of sulfated derivatives on HMEC migration after 24 h t reatment

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Preparation of Gri f ol a f rondos a polysaccharide sulfatedderivatives and their inhibitory effects on HMEC migration

MAO Yi-rong, ZHANGYi, ZHANG Hong-xia,WEN GLiang, ZHANG Hong-feng

(School of L i f e Science , East China N ormal Universi t y , S hanghai 200062 , China)

Polysaccharides f rom Gri f ola f rondosa ( GFP) were ext racted by hot water and precipitatedby 95 % EtOH. GFP1-F ,GFP1-M and GFP1-L were further purified by DEAE-celluloseand Sephadex G-100 subsequently f rom GFP. GFP1-F , GFP1-M and GFP1-L were glucan withmolecular weight1.09×105,1.93×104and 2.76×103Da.GFP1-FS , GFP1-MS and GFP1-LSwere polysaccharide sulfates obtained f rom GFP1-F , GFP1-M and GFP1-L with chlorosulfonicacid-pyridine. The IR spect rum of GFP1-FS , GFP1-MS and GFP1-LS showed the characteristicabsorptions of sulfate ester bond at 1 230cm-1and 810 cm-1.The13C NMR result s indicated themodification mainly occurred at C-6 of the polysaccharide sulfates. GFP1-MS had the greatestsulfated degree with DS 1. 07 , while DSs of GFP1-FS and GFP1-LS were 0. 66 and 0. 61 respectively.The scratching assay suggested that 73. 33 % , 34. 17 % and 67. 21 % cells migrated toscratching area compared with cont rol af ter 24-hour t reatment of 1 000μg/ mL GFP1-FS , GFP1-MS and GFP1-LS respectively. So that all the three sulfated derivatives had inhibitory effect s onHMEC migration , especially GFP1-MS had the st rongest activity which may be related with it scomplicated branch st ructure.

Gri f ola f rondosa ; glucan ; sulfated derivative ; HMEC; migration

Q28

A

1000-5641(2010)04-0092-11

2009-04

毛逸嶸,女,碩士研究生.

張紅鋒,女,副教授.研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué).E-mail:hfzhang@bio.ecnu.edu.cn.