賈杏林 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

齊長(zhǎng)明 (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

沈志強(qiáng)， 田鳳榮，莊金秋 (山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256618)

PCR和染色鏡檢方法診斷豬附紅細(xì)胞體的比較

賈杏林
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

齊長(zhǎng)明
(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

沈志強(qiáng)， 田鳳榮，莊金秋
(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256618)

參照Hoelzle等報(bào)道的豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasmasuis)PCR診斷方法，提取病原DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測(cè)序得到781 bp片段，與Genbank中序列(登錄號(hào)AJ504999)進(jìn)行比較，同源性為99.4%。用該方法從大腸桿菌等豬常見(jiàn)病原基因組未擴(kuò)增出相同的序列，表明其特異性好。以PCR和染色鏡檢方法分別檢測(cè)3個(gè)豬場(chǎng)15份臨床發(fā)病豬血液樣品，M.suis陽(yáng)性率均為100%，結(jié)果符合率為100%，差異不顯著(Pgt;0.05)；PCR檢測(cè)和涂片染色鏡檢5個(gè)豬場(chǎng)25份臨床健康豬血樣，M.suis陽(yáng)性率分別為100%和68.0%，二者符合率為68.0%，差異顯著(Plt;0.05)。

豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasmasuis)；PCR；染色鏡檢

豬附紅細(xì)胞體(Mycoplasmasuis)病是一種以貧血、黃疸和發(fā)熱為主要特征的人畜共患病,我國(guó)多個(gè)省市都有該病發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在該病的病原學(xué)診斷方法中，確診豬群慢性感染標(biāo)準(zhǔn)是脾切除和顯微鏡觀察來(lái)證實(shí)豬的寄生蟲(chóng)血癥，通過(guò)臨床癥狀來(lái)證實(shí)急性發(fā)病[2],但此法不適合群體診斷。血液涂片染色鏡檢方法是目前診斷該病原最常用的方法，該方法快速簡(jiǎn)便，但有學(xué)者認(rèn)為豬紅細(xì)胞形態(tài)變化可以由許多因素導(dǎo)致[3],因此形態(tài)學(xué)診斷結(jié)果的可靠性需要進(jìn)一步研究。Hoelzle等報(bào)道了PCR診斷方法,該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，適合大量樣品的檢測(cè)[4]。本研究對(duì)M.suis涂片染色鏡檢方法和PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)豬血 15份患病豬血采自山東省表現(xiàn)出豬附紅細(xì)胞體病臨床癥狀的3個(gè)豬場(chǎng)，病豬皮膚發(fā)紅，體溫40.0～41.5 ℃,采食減少、飲水增加；25份臨床健康豬血采自山東省5個(gè)豬場(chǎng)，豬臨床指標(biāo)正常。所有血液樣品用肝素鈉抗凝，血液涂片后姬姆薩染色見(jiàn)紅細(xì)胞周?chē)形⑸锔街?，呈小突起狀，SPF豬血由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)司興奎博士饋贈(zèng)。

(2)對(duì)照細(xì)菌和病毒 鏈球菌購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，巴氏桿菌、大腸桿菌O78、沙門(mén)氏菌由山東濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；羊邊蟲(chóng)、巴貝斯焦蟲(chóng)基因組由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)；豬弓形體抗原購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所；PRRSV由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所饋贈(zèng)；PRV為疫苗毒株。

(3)酶及主要試劑 pUC18-T、蛋白酶K、IPTG、X-gal、DNA膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海生物工程公司。CTAB購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)中心。

(4)引物的設(shè)計(jì)與合成 引物參照Hoelzle 等[4]的方法由上海生工合成，上游引物(P1)為5’-GCATTGCCCAGTCCCCAAGGA-3’，下游引物(P2)為5’-TGCGGGGAGTACGTGGGAAGG-3’。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)病原DNA的提取M.suis基因組的提取參照Hoelzle等[4]的方法略作改動(dòng)。取500 μL豬血加入1.5 mLEP管中，13 000 r/min離心20 min，棄去上清；沉淀中加入400 μLTE(pH 8.0)溶解，然后加入15 μL溶菌酶混勻后37 ℃水浴1 h，再加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和70μL10%SDS溶液56 ℃水浴30min；加入 100 μL5 mol/L NaCl溶液和160 μL5%CTAB溶液，65 ℃水浴10 min；加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提2次，等體積冷異丙醇沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min；70%乙醇溶液漂洗1次，干燥，TE(pH8.0)溶解，-20 ℃保存。弓形體、鏈球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌和巴氏桿菌培養(yǎng)離心后，基因組的提取同上述方法。PRV和PRRSV基因組提取按文獻(xiàn)[5,6]的方法進(jìn)行。

(2)PCR擴(kuò)增 50 μL體系中加入5 μL 10×Buffer溶液，31.5 μLddH2O，4 μL25 mmol/L MgCl2溶液，3 μLdNTP，上、下游引物各2 μL，2 μLM.suis基因組，0.5 μLtaq DNA聚合酶，混勻，放入PCR儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)熱10 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。對(duì)照病毒、細(xì)菌用同樣的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(3)PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 將PCR產(chǎn)物加樣于1%瓊脂糖凝膠上電泳，2 000 bp Marker作對(duì)照，用回收試劑盒回收約大于780 bp的片段，回收產(chǎn)物連接到PUC18-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌液送上海生工測(cè)序。將所測(cè)得核苷酸序列片段與Hoelzle等[4]報(bào)道的診斷序列進(jìn)行同源性比較。

(4)PCR與涂片染色方法比對(duì)試驗(yàn) 用PCR與涂片染色鏡檢方法同步檢測(cè)8個(gè)豬場(chǎng)40份送檢豬血，分別統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性陰性結(jié)果，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂片染色結(jié)果

檢測(cè)40份血液樣品M.suis均為陽(yáng)性，紅細(xì)胞表面有點(diǎn)狀突起，形狀不規(guī)則，有染成紫色的M.suis附著(圖版Ⅱ圖1)。

2.2 M.suis診斷序列的擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大約780 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小一致。陰性對(duì)照未擴(kuò)增出片段(圖版Ⅱ圖2)。

2.3 測(cè)序分析及同源性比較

目的片段與PUC18-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，陽(yáng)性細(xì)菌送往上海生工測(cè)序，大小為781 bp，與Genbank上的M.suis相關(guān)序列(登錄號(hào)AJ504999)比較，同源性為99.4%，該診斷序列DNA在53 bp處A變成了G；在161 bp、246 bp、247 bp處各缺少一個(gè)C；780 bp和781 bp之間多出一個(gè)C，表明該P(yáng)CR方法擴(kuò)增的是M.suis特異性的條帶。

2.4 M.suis診斷序列擴(kuò)增的特異性

用該引物和反應(yīng)條件未從SPF豬血和豬弓形體、羊鞭蟲(chóng)、鏈球菌、巴貝氏焦蟲(chóng)、大腸桿菌、PRRSV、PRV、沙門(mén)氏桿菌、巴氏桿菌中未擴(kuò)增出該片段(圖版Ⅱ圖3)，表明該方法有較好的特異性。

2.5 比對(duì)試驗(yàn)

用涂片染色鏡檢方法與PCR同步檢測(cè)8個(gè)豬場(chǎng)送檢40份豬血，2種方法檢測(cè)結(jié)果總符合率為80.0%(32/40)，差異顯著(Plt;0.05)；其中3個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)15份血液樣品，M.suis陽(yáng)性率均為100%，二者符合率為100%，差異不顯著(Pgt;0.05)；檢測(cè)5個(gè)臨床健康豬場(chǎng)25份血液樣品，涂片染色方法M.suis陽(yáng)性率為100%，PCR檢測(cè)M.suis陽(yáng)性率為68.0%，二者符合率為68.0%，差異顯著(Plt;0.05)。

3 討論

血液涂片染色鏡檢是檢測(cè)M.suis的最快速簡(jiǎn)便直觀的方法，但其不足之處是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。Hoelzle等建立了診斷M.suis的PCR方法，通過(guò)斑點(diǎn)雜交證實(shí)了該方法的特異性[4]。本研究對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，擴(kuò)增到同源性高達(dá)99.4%的片段，用該方法未從其他常見(jiàn)豬病病原中擴(kuò)增到DNA片段，表明該方法有較好的特異性。

國(guó)外文獻(xiàn)少見(jiàn)豬附紅細(xì)胞體病暴發(fā)和豬嚴(yán)重死亡的報(bào)道，且多以貧血、黃疸等慢性疾病為主，而國(guó)內(nèi)多以大面積暴發(fā)、高熱紅皮、死亡率高為主，出現(xiàn)這種情況可能是由于病原變異所致，但目前關(guān)于該病的分子流行病學(xué)研究報(bào)道較少，因而急需進(jìn)行該方面的研究，為更好的防制該病提供基礎(chǔ)。

本研究采用2種方法分別檢測(cè)同一血樣，對(duì)臨床發(fā)病豬二者符合率高達(dá)100%，但對(duì)M.suis病原攜帶臨床健康豬符合率大大降低。究其原因，一方面是由于染色鏡檢可能存在假陽(yáng)性等局限，另一方面與發(fā)病豬本身攜帶病原，其單位體積血樣病原數(shù)可能更多有關(guān)。因此，在對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的疑似病例進(jìn)行確診時(shí)結(jié)合PCR診斷是很必要的。

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2010-08-05

湖南省科技廳資助項(xiàng)目(2009FJ3021)；湖南省教育廳資助項(xiàng)目(10C0809)

賈杏林(1970-)，男，湖北天門(mén)人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，主要從事動(dòng)物輸血與血液病研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.012

S852.62

A

1673-1409(2010)03-S032-03