劉琦，王述森，高錦蘭，曹麗華，羅陽

（中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)基因組學(xué)教研室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110001）

DCT1（DOC-1R terminal1，DCT1）基因是我們?cè)谘芯亢蜻x抑癌基因DOC-1R（Deleted in Oral Cancer-1 Related，CDK2AP2）過程中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因。在前期工作中，我們采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）完成了該基因全長cDNA克隆，并對(duì)DCT1序列進(jìn)行分析。結(jié)果提示DCT1與Y43F4B.7蛋白N端同源，并可能與DOC-1R功能上相關(guān)，可能為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。

本研究中，我們通過輻射雜交技術(shù)（radiation hybrid，RH）將DCT1定位于5q31。此外我們進(jìn)行了DCT1功能上的初步研究。我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-DCT1，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后觀察其細(xì)胞內(nèi)定位，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)DCT1在包括小腸、皮膚等在正常人類組織中的表達(dá)水平。我們的研究為進(jìn)一步深入研究該基因在細(xì)胞內(nèi)的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PyrobestTMDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、DNA片段回收純化試劑盒及SYBR Premix EX TaqTM定量PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；Standford G3 RH panel購自 Research Genetics公司；質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自QIAGEN公司；真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-C3為Clontech產(chǎn)品；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增引物自行設(shè)計(jì)，由寶生物工程（大連）有限公司商業(yè)合成并純化。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人類宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞在含10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 染色體定位分析

遵照Standford G3 RH panel，以DCT1上下游引物（上游5′-AGCAATAGCACAACCATGGTTC-3′，下游5′-GACCCATCACGATGCCTGC-3′） 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，每個(gè)克隆PCR擴(kuò)增結(jié)果分為陰性、陽性和可疑，進(jìn)行2次獨(dú)立反應(yīng)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 pEGFP-DCT1載體構(gòu)建

以BglⅡ/SalⅠ消化包含DCT1全部編碼序列的pFLAG-DCT1載體得到長度為1.5 kb的片段，以1%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收DCT1片段并將其常規(guī)克隆到載體pEGFP-C3BglⅡ/SalⅠ的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)［1］。挑選克隆進(jìn)行菌落PCR，將候選陽性克隆小量快速提取質(zhì)粒并以BglⅡ/SalⅠ限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA，經(jīng)測(cè)序分析得到重組載體并-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察

選擇對(duì)數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化傳至6孔培養(yǎng)板中，加入無抗生素含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長至60%～80%匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以pEGFP-DCT1為實(shí)驗(yàn)組，pEGFP-C3 為對(duì)照組，取 4 μg質(zhì)粒 DNA，按 LipofectamineTM2000試劑操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)過夜，通過Leica DMIRE2熒光顯微鏡觀察比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況并照相保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DCT1表達(dá)

取本實(shí)驗(yàn)室保存的16個(gè)正常人類組織（小腸、肝、皮膚、心、胃、食管、大腦、大腸、腎、胰腺、脾、子宮、肺、膀胱、卵巢以及肌肉）cDNA，建立應(yīng)用SYBR greenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系25 μl，上述DCT1上下游引物（10 mmol/L）各1μl，cDNA0.3 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，循環(huán)40次，Roter Gene2000檢測(cè)收集信號(hào)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 DCT1染色體定位于5q31

將PCR擴(kuò)增結(jié)果陽性記為1，陰性記為0，兩次不相同視為2，得到DCT1基因RH定位擴(kuò)增結(jié)果為：00000102000000000000000000000000010000000010100000000000001110000100100000001000000。將該結(jié)果輸入斯坦福人類基因組中心（Stanford Human Genome Center，SHGC）主頁分析，DCT1 定位于5q31。以DCT1基因cDNA序列為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，確定出DCT1精細(xì)遺傳學(xué)定位。本實(shí)驗(yàn)采用RH定位結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致。

2.2 pEGFP-DCT1載體構(gòu)建

將pFLAG-DCT1和pEGFP-C3質(zhì)粒分別以BglⅡ/SalⅠ雙酶切消化，分離純化線性化的pEGFPC3質(zhì)粒和DCT1片段。將二者以適當(dāng)比例連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性菌落、提取回收質(zhì)粒，用BglⅡ/SalⅠ雙酶切鑒定陽性重組子。當(dāng)有DCT1片段插入時(shí)，分別可以得到約1.5 kb和4.7 kb兩條帶；否則只有4.7 kb一條帶。圖1第6泳道顯示，重組載體在經(jīng)過BglⅡ/SalⅠ酶切消化后，出現(xiàn)長度約1.5 kb的片段，此片段的長度與第4泳道用同樣的酶消化的pFLAG-DCT1得到的DCT1片段長度一致，表明DCT1片段已經(jīng)插入到pEGFP-C3載體中，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)重組載體構(gòu)建成功。

2.3 pEGFP-DCT1后細(xì)胞定位分析

pEGFP-DCT1重組載體和pEGFP-C3對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的核膜和集聚體（aggresome）處均勻發(fā)出綠色熒光，而對(duì)照組綠色熒光則彌散于全細(xì)胞，熒光強(qiáng)度均勻一致（圖2），表明DCT1蛋白定位于細(xì)胞核膜。

2.4 熒光定量PCR方法對(duì)DCT1在正常人類組織中表達(dá)進(jìn)行定量分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以2-△△CT方法計(jì)算DCT1在各組織內(nèi)相對(duì)表達(dá)量，分別收集GAPDH CT與DCT1 CT，取平均值后得到均值，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行半定量數(shù)據(jù)分析［2］，得到相對(duì)于肌肉組織的各組織DCT1的表達(dá)情況。其中，小腸中DCT1表達(dá)量為肌肉組織中DCT1表達(dá)量的0.03倍，肝臟表達(dá)量為0.002 82倍，皮膚表達(dá)量為16.45倍，心臟為4.627倍，胃為2.345 7倍，食管0.037倍，大腦0.0043倍，大腸為0.752 6倍，腎為0.03倍，胰腺0.0723倍，脾為21.26倍，子宮為0.1975倍，肺為1.117倍，膀胱0.068倍，卵巢為0.157倍（表1）。

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域。細(xì)胞周期調(diào)控異常是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)已知細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）-細(xì)胞周期蛋白（cyclin）復(fù)合物的形成、激活與失活是細(xì)胞周期調(diào)控的分子基礎(chǔ)。癌基因與抑癌基因可作為CDK-周期蛋白活性的正負(fù)性調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡等的調(diào)控過程。

DCT1是我們?cè)谘芯亢蜻x抑癌基因DOC-1R過程中發(fā)現(xiàn)的其相關(guān)基因。我們采用RACE方法完成了新基因全長cDNA克隆，并得到其編碼蛋白的氨基酸序列。DCT1 cDNA全長為1 431 bp，編碼476個(gè)氨基酸，其編碼產(chǎn)物與線蟲的Y43F4B.7蛋白N端同源。序列分析表明，DCT1可能與DOC-1R功能相關(guān)，可能也是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。

DOC-1R（GenBank，AF089814）基因是1999 年張學(xué)等發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選抑癌基因。人的DOC-1R基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，定位于11q13，編碼蛋白含有126個(gè)氨基酸，57%與DOC-1基因編碼蛋白相同，其C端氨基酸74～126區(qū)域和DOC-1蛋白高度同源，86%氨基酸相同，并與線蟲蛋白Y43F4B.7局部有一定同源性［3～5］。Northern blot和RT-PCR顯示，DOC-1R基因在多種組織中均有表達(dá)，表明該基因可能是對(duì)維持脊椎動(dòng)物器官的功能具有重要作用的管家基因［6］。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，DOC-1R基因表達(dá)明顯抑制腫瘤細(xì)胞的體外集落形成能力［7］。應(yīng)用GST-DOC-1R重組蛋白和人胚腎293細(xì)胞抽提物進(jìn)行的體外pull-down試驗(yàn)表明，DOC-1R能夠與CDK2結(jié)合（未發(fā)表）。以上結(jié)果均提示，DOC-1R可能在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，對(duì)于通過G1/S限制點(diǎn)及S期生物學(xué)事件的調(diào)節(jié)具有重要的意義［8～10］。

本研究中，我們通過RH技術(shù)完成了基因染色體定位，將DCT1定位于5q31，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了我們的結(jié)果。生物信息學(xué)提示，DCT1可能為跨膜蛋白，且進(jìn)行了11次跨膜。為了驗(yàn)證以上預(yù)測(cè)結(jié)果，我們構(gòu)建了EGFP-DCT1融合表達(dá)的真核表達(dá)載體pEGFP-DCT1，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后通過熒光顯微鏡觀察DCT1的細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果表明，DCT1定位于核膜。此外，我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)DCT1在人類16個(gè)組織中的表達(dá)，我們的結(jié)果表明DCT1普遍表達(dá)，其表達(dá)水平在脾較高，在腎、大腦、食管及肝和小腸組織中表達(dá)水平較低，上述結(jié)果提示DCT1可能作為管家蛋白，對(duì)于維持細(xì)胞功能具有一定作用。

DCT1與DOC-1R分別與線蟲蛋白Y43F4B.7蛋白N端及C端同源，提示二者可能結(jié)合，且在功能上可能相關(guān)。DCT1對(duì)于細(xì)胞生命活動(dòng)調(diào)節(jié)的具體功能，其是否如DOC-1R一樣具有抑癌蛋白的作用及其在各個(gè)物種中的保守性，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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