劉亮，左靜，趙麗，王靜，郭建文，劉江惠，左連富

（河北醫(yī)科大學(xué) 第四醫(yī)院1.腫瘤研究所流式細(xì)胞室；2.腫瘤內(nèi)科，石家莊050011）

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前食管癌化療過(guò)程中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重影響了治療效果。因此，闡明食管癌化療的耐藥現(xiàn)象就十分重要。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族員2（ATP-binding cassetee transporter G2，ABCG2）是新發(fā)現(xiàn)的與化療耐藥有關(guān)的因子。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在多種腫瘤中高表達(dá)［1～3］，并且我們研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在食管癌中也有高表達(dá)［4］，認(rèn)為ABCG2參與了食管癌耐藥的形成。本實(shí)驗(yàn)采用遞增阿霉素（adriamycin，ADM）的濃度，來(lái)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞（Eca109）細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，建立耐藥食管癌細(xì)胞模型，并利用多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其生物學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器：ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；引物，上海生工生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；Trizol試劑，Gibco BRL公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司；PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)eppendorf公司；ABCG2抗體，Biolegend公司（用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）；ABCG2抗體（克隆號(hào)：sc-18841）購(gòu)自SANTA CRUZ公司（用于Western Blot方法檢測(cè)）。

1.1.2 細(xì)胞株：人食管癌Eca109細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，接種細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（補(bǔ)充青霉素、鏈霉素各100 U/L），培養(yǎng)器皿置于37℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株Eca109/ADM的誘導(dǎo)：采用藥物持續(xù)接觸濃度遞增誘導(dǎo)法［5］，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Eca109細(xì)胞接種于含低濃度ADM（0.002 μg/ml）的培養(yǎng)基中，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況不斷提高藥物濃度，直到細(xì)胞能在含ADM濃度為0.02 μg/ml的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)，歷時(shí)8個(gè)月。細(xì)胞命名為Eca109/ADM細(xì)胞。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)：采用MTT法檢測(cè)Eca109細(xì)胞、Eca109/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性。Eca109/ADM細(xì)胞在不含ADM的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后備用，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞、Eca109/ADM細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，分別接種到 96 孔板（200 μl/孔，約1×105個(gè)/孔），培養(yǎng)4 h細(xì)胞貼壁后，參照ADM對(duì)人的藥物血漿高峰濃度加入不同濃度的ADM（設(shè)3個(gè)復(fù)孔），再培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl（5 mg/ml）MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl/孔，充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)每孔A490 nm值。計(jì)算細(xì)胞存活率（存活率=實(shí)驗(yàn)組A490 nm值/對(duì)照組A490 nm值×100%），應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），從而計(jì)算耐藥指數(shù)（RI）=耐藥細(xì)胞 IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2mRNA的表達(dá)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，加入1 ml Trizol試劑，常規(guī)一步法提取總RNA。RT-PCR方法采用兩步法［6］，ABCG2 上游引物5′-GGTCAGAGTGTGGTTTCTGTAGCA-3′，下游引物5′-GTGAGAGATCGATGCCCTGCTTTA-3′。 擴(kuò)增片段280 bp。GAPDH 上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTG-3′，擴(kuò)增片段452 bp。擴(kuò)增條件為94℃5 min，94℃30 s，63.1℃30 s，72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像分析儀下成像，用Gel-proAnalyzer3.1軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算ABCG2OD值/GAPDHOD值的比值，對(duì)ABCG2 mRNA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行光密度半定量分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，用0.25%胰酶消化，4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗2次細(xì)胞后，離心棄去上清液，冷PBS液將沉淀細(xì)胞重懸成1×106/100 μl，向細(xì)胞懸液中加入FITC標(biāo)記的ABCG2抗體，避光作用2 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)量，以平均熒光強(qiáng)度表示蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，使用RIPA試劑常規(guī)方法提取細(xì)胞蛋白。常規(guī)Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白，其中β-actin為內(nèi)參照。對(duì)條帶進(jìn)行掃描，并用Gel-Pro Analyzer3.1軟件分析條帶的光密度值，計(jì)算ABCG2條帶OD/β-actin條帶OD值，作為ABCG2的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 藥物外排實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109、E－ca109/ADM細(xì)胞4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加0.02 μg/mlADM作用2 h后，棄去上清液，換無(wú)ADM藥物的含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。棄去上清，冷PBS液洗滌細(xì)胞兩遍。收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)的ADM受488 nm的激光激發(fā)后能產(chǎn)生紅色熒光，可被流式儀接收，測(cè)出熒光強(qiáng)度，從而反映細(xì)胞內(nèi)ADM的含量。每組設(shè)6復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞株Eca109/ADM細(xì)胞培養(yǎng)

歷時(shí)8個(gè)月，成功培養(yǎng)了耐藥細(xì)胞株Eca109/ADM。與Eca109細(xì)胞相比，Eca109/ADM細(xì)胞體積變大，形態(tài)更不規(guī)則。見(jiàn)圖1。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

MTT方法檢測(cè)，ADM藥物作用Eca109/ADM細(xì)胞、Eca109細(xì)胞24 h，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5計(jì)算 IC50值，分別為15.45±1.15，4.69±0.88，耐藥系數(shù)為3.29倍。

2.3 RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2mRNA的表達(dá)

Eca109、Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2mRNA的表達(dá)量分別為0.67±0.04、0.82±0.10，Eca109/ADM 細(xì)胞中ABCG2mRNA的表達(dá)顯著增高（P<0.05）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)

Eca109/ADM細(xì)胞、Eca109細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)量分別為 659.88±10.60、628.25±12.49，Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)量較Eca109細(xì)胞顯著性增高（P<0.01）。

2.5 Western Blot方法檢測(cè)細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)

Eca109/ADM細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)量較Eca109細(xì)胞增高，見(jiàn)圖2。

2.6 藥物外排實(shí)驗(yàn)

Eca109/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM的含量與Eca109細(xì)胞內(nèi)ADM的含量相比降低，Eca109/ADM細(xì)胞外排ADM的作用較Eca109細(xì)胞增加。見(jiàn)圖3。

3 討論

抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療達(dá)不到預(yù)期效果甚至失敗的主要原因之一。ADM是蒽環(huán)類細(xì)胞毒抗生素，是一種廣譜抗腫瘤藥物，對(duì)多種腫瘤的治療有較好的療效，由于它的抗腫瘤活性強(qiáng)，所以在臨床化療中被廣泛應(yīng)用，占有重要地位。但是ADM具有很大的毒副作用和易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其在臨床上的作用。要提高其臨床療效，需逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)其耐藥。ABCG2是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的與多藥耐藥相關(guān)的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一［7～10］，具有將化療藥物米托蒽醌、ADM等從腫瘤細(xì)胞泵出的作用，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。

本研究采用藥物濃度遞增法，體外誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞系Eca109/ADM，建立食管癌耐藥細(xì)胞模型，研究ABCG2與食管癌耐藥的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)從ADM0.002 μg/ml濃度開(kāi)始逐漸增加藥物的濃度，最終使細(xì)胞在0.02 μg/ml ADM中穩(wěn)定生長(zhǎng)。藥物濃度增長(zhǎng)10倍，在此過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞體積變大，形態(tài)變得更不規(guī)則。應(yīng)用MTT方法檢測(cè)到E－ca109/ADM細(xì)胞對(duì)ADM產(chǎn)生了耐藥，耐藥系數(shù)為3.29。接下來(lái)研究Eca109/ADM細(xì)胞的耐藥機(jī)制，應(yīng)用了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)Eca109/ADM細(xì)胞耐藥因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ABCG2mRNA及蛋白在Eca109/ADM細(xì)胞中高表達(dá)，提示ABCG2參與了Eca109/ADM細(xì)胞耐藥形成。同時(shí)我們還利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了Eca109/ADM細(xì)胞外排藥物作用，發(fā)現(xiàn)Eca109/ADM細(xì)胞外排ADM作用增加，提示Eca109/ADM細(xì)胞中高表達(dá)的ABCG2可以外排ADM，從而使Eca109/ADM細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。

綜上研究，本實(shí)驗(yàn)所誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株Eca109/ADM是一個(gè)典型的具有ABCG2表型的耐藥模型，并且高表達(dá)ABCG2。提示ABCG2有望成為食管癌耐藥逆轉(zhuǎn)治療的新靶點(diǎn)。

［1］Diestra JE，Scheffer GL，Catala I，et al.Frequent expression of the multi-drug resistance-associated protein BCRP/MXR/ABCP/ABCG2 in human tumours detected by the BXP-21 monoclonal antibody in paraffin embedded material［J］.J Pathol，2002，198（2）：213-219.

［2］Robey RW，Medina-Perez WY，Nishiyama K，et al.Overexpression of the ATP-binding cassette half-transporter，ABCG2 （Mxr/BCrp/ABCP1），in flavopiridol-resistant human breast cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2001，7（1）：145-152.

［3］Plasschaert SL，Van Der Klolk D，De Bont ES，et al.Breast cancer resistance protein（BCRP）in acute leukemia［J］.Leuk Lymphoma，2004，45（4）：649-654.

［4］劉亮，趙麗等.三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2基因在食管癌中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37（6）：776-778.

［5］Yang LY，Trujillo JM.Biological characterization of multidrug-resistant human colon carcinoma sublines induced/selected by two methods［J］.Cancer Res，1990，50（11）：3218-3225.

［6］Larbcharoensub N，Leopairat J，Sirachainan E，et al.Association between multidrug resistance-associated protein1and poor prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma treated with radiotherapy and concurrent chemotherapy［J］.Hum Pathol，2008，39（6）：837-845.

［7］Imai Y，Tsukahara S，Asada S，et al.Phytoestrogens/flavonoids reverse breast cancer resistance protein/ABCG2-mediated multidrug resistance［J］.Cancer Res，2004，64（12）：4346-4352.

［8］Tsunoda S，Okumura T，Ito T，et al.ABCG2 expression is an independent unfavorable prognostic factor in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Oncology，2006，71（3-4）：251-258.

［9］Choudhuri S，Klaassen CD.Structure，function，expression，genomic organization，and single nucleotide polymorphisms of human ABCB1（MDR1），ABCC （MRP），and ABCG2 （BCRP）efflux transporters［J］.Int J Toxicol，2006；25（4）：231-259.

［10］Salphati L，Plise EG，Li G.Expression and activity of the efflux transporters ABCB1，ABCC2 and ABCG2 in the human colorectal carcinoma cell line LS513［J］.Eur J Phamaco Sci，2009；37（3-4）：463-468.